产仔数在养猪生产中是影响养猪效率的重要因素之一，而猪妊娠过程中的胚胎死亡会很大程度影响产仔数。在猪中大部分胚胎死亡都发生在胚胎附植期。子宫腔从空间上分为系膜侧和系膜对侧，系膜侧直接与母体相连接，负责输送氧气、营养物质等给胚胎。在胚胎附植期间，猪胚胎会经历延伸并移动到系膜侧子宫内膜发生定向附植(Ross et al. 2009, Kridli et al. 2016)，因此猪子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜会分别为定向附植的胚胎做出不同的响应。本研究以胚胎附植期(妊娠12天和15天)梅山母猪为研究对象，首先采集子宫制作切片并进行HE染色观察母胎界面特征，随后采集子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜样品分别进行RNA-seq和miRNA-seq测序，并鉴定了时空特异表达的mRNA、miRNA和lncRNA，通过对三套数据的整合分析，分析影响胚胎定向附植的lncRNA-miRNA-mRNA互作调控网络，并进行初步的验证。具体结果如下：
　　1.猪胚胎附植期胚胎定向附植表型的鉴定
　　通过全切片扫描系统对猪胚胎附植期子宫HE染色结果进行扫描，我们发现在妊娠12天，线状胚胎悬浮于子宫中并向系膜侧子宫移动，但尚未与子宫内膜发生接触。到妊娠15天，子宫内膜相互嵌合将子宫腔闭合，从而将胚胎移动的范围限制在系膜侧子宫，同时进一步延伸的线状胚胎与系膜侧子宫内膜腔上皮细胞接触并成功附植。
　　2.猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关基因的筛选及功能分析
　　通过对妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜RNA-seq测序数据进行分析，我们在妊娠12天与15天子宫系膜侧子宫内膜中得到1753个时期间差异表达基因，在妊娠12天与15天子宫系膜对侧子宫内膜中得到1535个时期间差异表达基因。同时，我们在妊娠12天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间得到5个差异表达基因，在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间得到240个差异表达基因。这些结果说明在猪妊娠12天与15天子宫内膜中，除了大量时期特异表达的基因以外，系膜侧和系膜对侧子宫内膜间还存在大量部位特异表达的基因参与调控胚胎定向附植的过程。并且在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间差异表达的基因中，趋化因子及其受体(CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCR3、CXCR4、CXCR7)、整合素及其相关基因(ITGB2、ITGAL、ITGAM、ICAM1)、选择素及其配体(SELL、SELE、SELP、CD34)等与免疫细胞募集相关的基因都在妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜上调表达。这些妊娠15天部位间差异表达的基因可能通过定向募集免疫细胞等方式调控胚胎定向附植。
　　3.猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关基因的miRNA筛选及功能分析
　　通过对妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜的miRNA-seq数据进行分析，我们在妊娠12天与15天子宫系膜侧子宫内膜中得到45个时期间差异表达miRNA，在妊娠12天与15天子宫系膜对侧子宫内膜中得到41个时期间差异表达miRNA。同时，我们发现妊娠12天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间没有差异表达miRNA，在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间得到17个差异表达miRNA。通过整合RNA-seq和miRNA-seq的数据，我们发现在妊娠12天与15天子宫内膜间差异表达且具有反向表达模式的ALCAM-miR-142-3p与STMN1-miR-101具有潜在调控关系，在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间差异表达且具有反向表达模式的CXCL11-miR-9、CXCR4-miR-9、ITGB8-miR-142-3p具有潜在调控关系，并使用双荧光素报告酶系统进行了验证。这些结果说明在猪妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中，miRNA也存在与基因类似的时空特异表达模式，并可能通过调控其靶基因参与调控胚胎定向附植的过程。
　　4.猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关基因的lncRNA筛选及功能分析
　　通过对妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜链特异性建库的RNA-seq数据中的lncRNA进行鉴定与分析，我们在妊娠12天与15天子宫系膜侧子宫内膜中得到193个时期间差异表达lncRNA，在妊娠12天与15天子宫系膜对侧子宫内膜中得到210个时期间差异表达lncRNA。同时，我们在妊娠12天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜间得到14个差异表达lncRNA，在妊娠15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜间得到49个差异表达lncRNA。通过对mRNA与lncRNA共表达模式进行分析，并结合lncRNA与mRNA的位置关系，同时考虑miRNA与靶基因的反向表达模式，我们得到了miRNA-mRNA-lncRNA在妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中的调控互作网络。此外，通过预测可能作为ceRNA的lncRNA，我们发现GTF2H1-AS、CNOT2-AS和TCNOS_00080623与miR-9在妊娠15天系膜侧与系膜对侧子宫内膜间具有反向表达模式且它们的序列中都存在miR-9的潜在结合位点，随后我们使用双荧光素报告酶系统对这种ceRNA的调控关系进行了验证。这些结果说明在猪妊娠12天和15天子宫内膜中，lncRNA也存在与基因类似的时空特异表达模式，并可能通过与基因的互作或内源性竞争结合miRNA来调控与胚胎定向附植相关基因来影响胚胎定向附植的过程。
　　5.猪胚胎附植期调控猪胚胎定向附植相关候选通路的筛选
　　通过整合lncRNA-miRNA-mRNA的数据，我们推测在妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜高表达的GTF2H1-AS、CNOT2-AS和TCNOS_00080623可以作为ceRNA竞争性结合在妊娠15天子宫系膜对侧子宫内膜高表达的miR-9，这会导致miR-9的靶基因CXCL11和CXCR4在妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜高表达，最终在系膜侧子宫内膜形成更高的趋化因子浓度。更多的免疫细胞会募集到拥有更高趋化因子浓度的系膜侧子宫内膜，这最终为系膜侧子宫内膜达到免疫平衡状态来接受胚胎定向附植提供了重要保障。并且，我们还通过免疫组化结果验证了更多的CD3+免疫细胞募集到妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜的现象。
　　6.与猪胚胎定向附植相关基因中SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析
　　我们从猪胚胎定向附植相关候选通路中选择了与猪胚胎定向附植相关的6个基因(CXCR4、CXCL11、ALCAM、STMN1、ITGB8、MMP8)，并鉴定了这6个基因中8个SNP位点。通过在丹系大白猪群体中对这些SNP位点进行基因分型并与母猪繁殖性状(总产仔数、产活仔数、有效活仔数、5日龄活仔数、死胎数、木乃伊胎数、妊娠期长和胎间距)进行关联分析，我们发现这6个基因中的8个SNP位点均与母猪繁殖性状显著关联。这些结果说明这些SNP位点在育种实践中可以作为母猪繁殖性状选育的潜在分子标记。