论文部分内容阅读
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),属于芽孢杆菌属(Bacillus),简称Bt,典型的革兰氏阳性菌(G+),广泛分布于自然界中土壤、水、枯枝落叶以及动物尸体中。1901年日本科学家S.Ishiwata从家蚕中发现,后由德国科学家Berliner从地中海粉螟(Ephestia kuehniella)分离并命名。苏云金芽孢杆菌作为一种广泛应用的生物农药而闻名于世。其生长过程中产生的杀虫晶体蛋白以及毒素能有效的杀死鳞翅目等农业害虫,在化学农药引起的粮食污染、环境污染和抗药性问题日益突出的当代,苏云金芽孢杆菌在虫害防治方面的作用显的越来越重要。
苏云金芽孢杆菌除了在害虫防治方面有重要的作用,其在微生物病害防治方面的新型作用也在近些年来得到充分证明。本论文指导老师张炼辉教授实验室首次证明苏云金芽孢杆菌的aiiA基因编码产生细菌群体感应信号AHLs的降解酶,其后,本实验室及国内外其他研究者发现aiiA同源基因广泛存在于芽孢杆菌和其他一些细菌之中。其编码产生的AiiA是由250个氨基酸构成的多肽,其中包含“HXHXDH”特征的锌离子结合位点。研究证明转入aiiA基因后得到的转基因病原细菌致病力有效降低,得到的转基因植物抗病性得到提高,同时,表达 aiiA基因的苏云金芽孢杆菌对依赖于AH L群体感应系统的微生物病害有明显的防治效果,但 aiiA基因在芽孢杆菌中的生物学功能目前尚未有深入研究。本研究论文以苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)B23及其aiiA基因敲除突变体△aiiA为研究对象,研究分析了野生型和突变体的生物膜、黑色素产量以及群集性运动 Swarming等生物表型差异,利用高通量二代测序转录组分析技术,结合 qRT-PCR方法,同时利用生物学技术与化学分析手段,较为系统的对苏云金芽孢杆菌B23菌株中a iiA基因功能及其可能存在的群体感应现象进行了探究,旨在为全面研究揭示芽孢杆菌中aiiA基因的功能和群体感应系统奠定基础。
本论文研究结果表明:1、苏云金芽孢杆菌B23敲除突变a iiA基因后,菌体的生长繁殖受到的影响不明显,但其它多个生物表型受到影响,其中最为明显的是突变体△aiiA的生物膜产量提高、群集性运动性(swarming)受到抑制,黑色素产量降低,实验结果说明aiiA基因产物与生物膜和黑色素的产量以及群集性运动性有密切关系;2、液体发酵△aiiA后获得的提取物对野生型B23和绿脓杆菌群集性运动性具有抑制活性,而野生型B23发酵液提取物没有抑制活性,表明突变体△a iiA可能积累一种对细菌群集性运动性有抑制作用的化合物;3、转录组测序分析后表明,突变体△a iiA中有大量基因的表达受到影响。进行基因差异表达Gene Ontology分析统计后显示与生物过程相关的基因表达量受到影响的基因最多,其中参与细胞新陈代谢、色素形成等生物过程多数基因受到aiiA基因影响表达量变化最为显著。其中 AI-2信号合成基因luxS以及趋化性蛋白CheY在转录水平上明显下调,利用qRT-PCR技术进行定量分析表明,在突变体△aiiA中lux S基因转录水平下调近75%,che Y转录水平下调近60%,证明aiiA基因与AI-2信号及趋化性蛋白CheY的合成有关。
综上所述,本实验证明aiiA基因产物对苏云金芽孢杆菌的一些生理生化过程起重要的调控作用,尤其是细菌的涌动性和生物膜的形成。本文首次发现苏云金芽孢杆菌B23菌株aiiA突变体的发酵提取物能够抑制细菌群集性运动性。结合本实验结果和其他研究者的发现,作者推测aiiA的产物可能通过影响一些调控因子基因,如 AI-2群体感应信号合成酶基因lux S和趋化性调控蛋白基因cheY的转录表达,进而调控上述细菌的生理生化功能。本文结果为今后深入解析 A iiA的生物学功能提供了有用的线索。
苏云金芽孢杆菌除了在害虫防治方面有重要的作用,其在微生物病害防治方面的新型作用也在近些年来得到充分证明。本论文指导老师张炼辉教授实验室首次证明苏云金芽孢杆菌的aiiA基因编码产生细菌群体感应信号AHLs的降解酶,其后,本实验室及国内外其他研究者发现aiiA同源基因广泛存在于芽孢杆菌和其他一些细菌之中。其编码产生的AiiA是由250个氨基酸构成的多肽,其中包含“HXHXDH”特征的锌离子结合位点。研究证明转入aiiA基因后得到的转基因病原细菌致病力有效降低,得到的转基因植物抗病性得到提高,同时,表达 aiiA基因的苏云金芽孢杆菌对依赖于AH L群体感应系统的微生物病害有明显的防治效果,但 aiiA基因在芽孢杆菌中的生物学功能目前尚未有深入研究。本研究论文以苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)B23及其aiiA基因敲除突变体△aiiA为研究对象,研究分析了野生型和突变体的生物膜、黑色素产量以及群集性运动 Swarming等生物表型差异,利用高通量二代测序转录组分析技术,结合 qRT-PCR方法,同时利用生物学技术与化学分析手段,较为系统的对苏云金芽孢杆菌B23菌株中a iiA基因功能及其可能存在的群体感应现象进行了探究,旨在为全面研究揭示芽孢杆菌中aiiA基因的功能和群体感应系统奠定基础。
本论文研究结果表明:1、苏云金芽孢杆菌B23敲除突变a iiA基因后,菌体的生长繁殖受到的影响不明显,但其它多个生物表型受到影响,其中最为明显的是突变体△aiiA的生物膜产量提高、群集性运动性(swarming)受到抑制,黑色素产量降低,实验结果说明aiiA基因产物与生物膜和黑色素的产量以及群集性运动性有密切关系;2、液体发酵△aiiA后获得的提取物对野生型B23和绿脓杆菌群集性运动性具有抑制活性,而野生型B23发酵液提取物没有抑制活性,表明突变体△a iiA可能积累一种对细菌群集性运动性有抑制作用的化合物;3、转录组测序分析后表明,突变体△a iiA中有大量基因的表达受到影响。进行基因差异表达Gene Ontology分析统计后显示与生物过程相关的基因表达量受到影响的基因最多,其中参与细胞新陈代谢、色素形成等生物过程多数基因受到aiiA基因影响表达量变化最为显著。其中 AI-2信号合成基因luxS以及趋化性蛋白CheY在转录水平上明显下调,利用qRT-PCR技术进行定量分析表明,在突变体△aiiA中lux S基因转录水平下调近75%,che Y转录水平下调近60%,证明aiiA基因与AI-2信号及趋化性蛋白CheY的合成有关。
综上所述,本实验证明aiiA基因产物对苏云金芽孢杆菌的一些生理生化过程起重要的调控作用,尤其是细菌的涌动性和生物膜的形成。本文首次发现苏云金芽孢杆菌B23菌株aiiA突变体的发酵提取物能够抑制细菌群集性运动性。结合本实验结果和其他研究者的发现,作者推测aiiA的产物可能通过影响一些调控因子基因,如 AI-2群体感应信号合成酶基因lux S和趋化性调控蛋白基因cheY的转录表达,进而调控上述细菌的生理生化功能。本文结果为今后深入解析 A iiA的生物学功能提供了有用的线索。