研究背景据2006年报道,仅美国每年约有600万婴幼儿在全身麻醉(全麻)下接受手术,其中婴儿约150万；尽管中国目前尚无相关数据,但基于国内的人口规模,每年接受全麻手术的婴幼儿应比美国多。由于人类神经系统发育始于妊娠4-5w,而止于出生后若干年后；一般认为人类大脑发育高峰期在妊娠后期至出生后6m。因此全麻是否对患儿智力发育及其长期认知功能产生不良影响是近年来备受关注的热点问题。已有临床研究表明,婴幼儿时期,特别是两岁以内的婴儿接受全身麻醉会导致较长时期的行为改变,提示全麻药可能损害婴幼儿中枢神经系统。近年来基础研究发现,在神经系统发育关键期(啮齿类动物为出生前两天到出生后1～2w),全麻药(异氟烷、七氟烷、地氟烷、氯胺酮及异丙酚)影响动物发育期神经系统突触可塑性,并导致发育期神经元凋亡及其它退行性神经病变,最后影响成年期动物的学习记忆功能。吸入麻醉药在临床麻醉中应用非常广泛。新近研究表明,吸入麻醉药异氟烷致发育期神经元内钙稳态失衡,最终触发线粒体途径凋亡。但是吸入麻醉药影响线粒体结构和功能的确切机制尚不清楚。如果小儿全麻不可避免,那么阐明吸入麻醉药导致线粒体结构和功能异常的准确机制,并探索有效的防治手段,是亟待解决的难题之一。线粒体是一个不断进行分裂、融合等动态变化的细胞器,这种动态变化称为线粒体动力学。线粒体分裂／融合主要受一下两组蛋白的调控：(1)调节线粒体分裂的drp-1(dynamin-related protein)、 mff (mitochondrial fission factor)、 FIS1;(2)调节线粒体融合的mfn (mitofusionl)1mfn2、OPA1(optic atrophy1)。生理状况下,线粒体分裂/隔合既决定线粒体形状和大小,也调节线粒体的分布和功能,对维持细胞生理功能发挥重要作用。已有研究发现,神经元内线粒体分裂/融合异常影响神经突生长、突触形成、长时程增强,甚至神经元凋亡等。调节线粒体分裂、融合的蛋白参与了很多神经退行性疾病过程中神经元凋亡和突触联系障碍等病理变化。在凋亡早期,哺乳动物细胞中drp-1活性增加,促进线粒体碎片化和分裂,增加线粒体膜的通透性,促使细胞色素C(cytochrome C, cyto-C)释放,最终触发线粒体途径凋亡。在阿尔茨海默病和亨廷顿舞蹈症等研究中发现,p淀粉样蛋白(Aβ)、亨廷顿蛋白((huntingtin, HTT)及帕金蛋白(Parkin)都可促使神经元内dr-1表达上调且与drp-1相互作用,激活drp-1,促进线粒体过度分裂甚至碎片化,进而导致线粒体动力学异常,甚至神经元凋亡并损害突触联系的建立,最终导致患者长期认知功能障碍。由此可见,线粒体异常分裂是凋亡的早期表现；神经元线粒体分裂、融合失衡是退行性神经病变的病理生理基础。神经元胞浆Ca2+可通过多种信号通路调控线粒体动力学蛋白活性,继而调节线粒体动力学,影响神经元存活及其他功能。在伤害性刺激下,神经元胞浆Ca2+浓度([Ca2+]C)持续升高,继而激活钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN),引起drp-1第637丝氨酸去磷酸化,导致drp-1活性增强并向线粒体移位,促进线粒体分裂,进而引起线粒体片段化甚至神经元凋亡,最终干扰突触联系及神经环路形成。本项目组的前期研究证实,临床相关浓度的异氟烷可致神经元[Ca2+]。升高。但是,异氟烷是否通过这条信号通路,引起线粒体分裂／融合失衡并最终导致发育期神经元毒性有待于进一步研究。因此本研究拟从离体细胞和在体动物水平,根据异氟烷作用后,线粒体形态及线粒体动力学调节蛋白表达的变化,选择对线粒动力学起重要作用的调节蛋白,阐述线粒体动力学失调在异氟烷抑制发育期神经元毒性作用中的机制。研究方法与结果1.异氟烷对发育期神经元线粒体形态学和膜电位的影响方法：体外培养第5d (DIV5)海马神经元随机分为对照组(C组)以及异氟烷组(I组)。C组在5%CO2-8%O2-87%N2三气培养箱中处理6h；I组以5%CO2-8%O2-87%N2作为载体气,1.5%异氟烷处理6h,采用电镜观察线粒体形态学的变化。DIV3海马神经元,转染CellLight(?) Mitochondria-RFP BacMan2.0,异氟烷处理后在激光共聚焦显微镜下观察线粒体的形态学改变结果：与C组比较,I组线粒体直接明显减小(P<0.05)。在转染了CellLight(?) Mitochondria-RFP BacMan2.0的神经元中,与C组比较,I组神经元变圆变小。2.异氟烷对发育期神经元线粒体膜电位的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为对照组(C组)以及异氟烷组(I组),处理同上。1.5%异氟烷处理6h。选用JC-1染色后在激光共聚焦显微镜和细胞流式仪下观察线粒体膜电位变化。结果：与C组标胶,I组神经元线粒体膜电位明显去极化(P<0.05)。3.异氟烷对发育期神经元内线粒体分裂/融合调节蛋白mRNA和蛋白表达水平的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为对照组(C组)以及异氟烷组(I组),处理同上。异氟烷结束后,提取总RNA和总蛋白,分别进行实时定量PCR和Western Blot (WB)方法检测线粒体动力学调节蛋白的mRNA和蛋白水平的表达变化结果：与C组相比,I组线粒体动力学调节蛋白在mRNA和蛋白水平的表达差异均无显著性(P>0.05)。4.异氟烷对发育期神经元p-drp-1表达的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为对照组(C组)以及异氟烷组(I组),处理同上。异氟烷麻醉结束后提取总蛋白,采用WB方法检测drp-1第637丝氨酸磷酸化的表达(p-drp-1(ser637))。选用免疫荧光双标检测p-drp-1(ser637)的表达变化。结果：与C组比较,I组p-drp-1(ser637)表达明显下调(P<0.05)。5.抑制drp-1对异氟烷诱发发育期神经元线粒体膜电位去极化的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为对照组(C组)、异氟烷组(I组)、mdivi-1预给药后异氟烷处理组(M+I组)及mdivi-1处理组(M组)。M+I组和M组在异氟烷处理2h前在无血清培养基中加入5μMmdivi-1,而后C组和M组载体气处理6h,I组和M+I组1.5%异氟烷处理6h。异氟烷处理结束后,进行JC-1染色,在激光共聚焦显微镜和细胞流式仪下检测线粒体膜电位。结果：与C组比较,M+I组和M组线粒体膜电位没有明显变化(P>0.05),I组线粒体膜电位明显去极化(P<0.05)；与I组比较,M+I组和M组线粒体膜电位水平较高(P<0.05)。6. Mdivi-1对异氟烷诱发发育期神经元线粒体形态学的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为C组、I组、M+I组、M组,处理同上。异氟烷处理结束后,采用电镜观察线粒体形态学的变化,采像后的图片在Imaris下进行处理统计。采用CellLight(?) Mitochondria-RFP BacMan2.0在海马神经元体外培养3d时转染,在异氟烷处理结束后,固定、封片后在激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态学改变。结果：与C组比较,M组及M+I组线粒体直径差异无统计学意义(P>0.05)；I组线粒体直径减小(P<0.05)；线粒体密度增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。与I组比较,M+I组线粒体直径增大(P<0.05)；线粒体密度差异无统计学意义(P>0.05)。7. Mdivi-1对异氟烷诱发发育期神经元存活率及凋亡相关蛋白表达的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为C组、I组、M+I组、M组,处理同上。采用WB检测细胞色素C (cytochrome C,cyto-C)的表达；采用免疫荧光双标检测active caspase3染色阳性细胞数目。结果：与C组比较,M组所检测指标差异无显著性(P>0.05)；I组AC3(active caspase3)和cyto-C蛋白表达上调,AC3阳性神经元数目增多(P<0.05)。与I组比较,M+I组cyto-C蛋白表达降低,AC3阳性神经元数目减少(P<0.05)。8.异氟烷对钙神经磷酸酶的表达和活性的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为对照组(C组)以及异氟烷组(I组),处理同上。采用试剂盒检测CaN活性；提取总蛋白,用WB方法检测CN表达。结果：与C组比较,CaN表达明显上调,活性明显增强(P<0.05)。9.CaN抑制剂FK506对异氟烷诱导的p-drp-1表达和线粒体形态学改变的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为对照组(C组)、异氟烷组(I组)FK506预给药后异氟烷处理组(F+I组)及FK506处理组(F组)。F+I组和F组在异氟烷处理2h前在无血清培养基中加入5μMFK506,而后C组合F组载体气处理6h,I组和F+I组1.5%异氟烷处理6h。异氟烷处理结束后,WB检测p-drp-1的表达。采用CellLight(?)Mitochondria-RFP BacMan2.0在海马神经元体外培养3d时转染,在异氟烷处理结束后,固定、封片后在激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态学改变,采像后的图片在Imaris下进行处理统计。结果：与C组比较,F组及F+I组所检测指标差异无显著性(P>0.05)；I组p-drp一1表达降低,线粒体直径减小(P<0.05)。与I组比较,F+I组p-drp-1表达升高,线粒体直径增加(P<0.05)。10.FK506对异氟烷诱导的发育期神经元凋亡的影响方法：体外培养第5d的海马神经元随机分为C组、I组、F+I组、F组,处理同上。采用WB检测cyto-C的表达；采用免疫荧光双标检测AC3的表达。结果：与C组相比,F组及F+I组所检测指标差异无显著性(P,0.05)；I组cyto-C蛋白表达上调,AC3阳性神经元数目增多(P<0.05)。与I组相比,F+I组cyto-C蛋白表达降低,AC3阳性神经元数目减少(P<0.05)。11.异氟烷对新生5d (postnatal5day, PND5)大鼠海马线粒体形态学的影响方法：PND5大鼠,随进分为C组合I组。C组吸入30%O2-70%N26h, I组以30%02-70%N2作为载气1.5%异氟烷处理6h,然后电镜灌注液灌注后,取标本放入2.5%戊二醛固定后,进行电镜检测。结果：与C组相比,I组海马线粒体直径减小(P<0.05),甚至有部分线粒体破裂。12.异氟烷对PND5大鼠海马线粒体动力学调节蛋白及p-drp-1表达的影响方法：PND大鼠1.5%异氟烷处理6h后,取海马组织,提取总蛋白和总RNA,采用WB和实时定量PCR检测线粒体动力学调节蛋白及p-drp-1的表达结果：与C组相比,I组海马线粒体动力学调节蛋白表达在mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05),但是p-drp-1表达明显降低(P<0.05)。13. Mdivi-1对异氟烷诱导的PND5大鼠海马神经元凋亡的影响方法：PND大鼠随机分为四组：C组、I组、M+I组及M组。C组和I组处理同前；M+I组在麻醉2h前腹腔注射5μg/kg mdivi-1,然后1.5%异氟烷处理6h；M组腹腔注射5μg/kg mdivi-1然后吸入30%O2-70%N2。麻醉结束后,尽取海马组织,提取总蛋白和总RNA,采用WB和实时定量PCR检测cyto-C的表达。1.5%异氟烷处理6h后,4%多聚甲醛固定,取大脑切片,采用免疫荧光双标检测AC3阳性神经元数目。结果：与C组相比,M+I组和M组所检测指标无明显差异(P>0.05)；I组cyto-C蛋白表达上调,AC3阳性神经元数目增多(P<0.05)。与I组相比,M+I组cyto-C表达降低,AC3阳性神经元数目减少(P<0.05)。14.Mdivi-1对异氟烷诱导的PND5大鼠长期认知障碍的影响方法：PND大鼠1.5%异氟烷处理6h后,待其完全清醒,送回原笼饲养至60d,进行水迷宫检实验检测其空间学习记忆功能。实验完成后,麻醉电镜固定液灌注固定后,取海马组织进行电镜检测线粒体形态的变化。结果：与C组比较,I组第3-5天时逃避潜伏期延长,探索时间缩短(P<0.05),M+I组和M组逃避潜伏期和探索时间差异无统计学意义(P>0.05)；与I组比较,M+I组第3-5d时逃避潜伏期缩短,探索时间延长(P<0.05)。电镜检测发现,与C组比较,I组线粒体直径减少(P<0.05),M+I组和M组差异无统计学意义(P>0.05)；与I相比,M+I组线粒体直径增加(P<0.05)。15.统计学分析采用SPSS20统计软件对数据进行分析,计量资料表示为均数±标准差(x±s),组间比较采用单因素方差分析,组内比较采用独立样本t检验；Morris水迷宫大鼠训练期间数据采用连续测量的方差分析,P<0.05为有统计学意义。研究总结一、主要研究结果1.通过体外原代海马神经元培养以及在体动物实验证明临床相关浓度的异氟烷导致发育神经元线粒体动力学失衡。2.体外及体内实验证实,异氟烷激活发育期神经元CaN,导致drp-1第637位丝氨酸去磷酸化,继而促使drp-1活性增加并向线粒体移位,导致线粒体过度分裂甚至碎片化,从而触发线粒体途径凋亡。3.体外及体内实验证实,drp-1抑制剂mdivi-1可减轻异氟烷发育期神经元凋亡,改善异氟烷所致长期认知功能障碍。二、研究结论异氟烷引起胞浆Ca2+浓度升高,激活CaN,促进drp-1(ser637)去磷酸化,引起drp-1活性增强并向线粒体移位,从而导致线粒体过度分裂甚至碎片化,继而导致线粒体膜通透性增加,cyto-C释放,触发线粒体凋亡途径,最终导致发育期神经系统损伤；而drp-1抑制剂mdivi-1则可减轻异氟烷所诱导神经元凋亡和长期认知功能障碍。