论文部分内容阅读
研究背景:近年来,慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）的患病率呈现出快速上升的趋势。据不完全统计,全球成年人中CKD的患病率已高达14.3%,其中我国成年人CKD的患病率约为1 1%,CKD若未得到及时有效的诊断和治疗,将会进一步发展为终末期肾脏病（end-stage renal disease,ESRD）,给社会带来沉重的负担。目前,数据统计表明,我国ESRD患者人数高达300余万,接受透析的患者约有70万人,其中腹膜透析（peritoneal dialysis,PD）患者约占总透析患者的11%。其具有血流动力学较稳定,残余肾脏的功能较好的保护,操作简单等诸多优势。然而,由于腹膜透析患者的腹膜组织长期暴露于生物不相容性的透析溶液中,以及其导致的腹腔慢性无菌性炎症状态,可导致腹膜细胞外基质（extracellular matrix,ECM）大量堆积,上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）及腹膜纤维化（peritoneal fibrosis,PF）。同时,腹腔的缺氧状态会使腹膜血管新生,使腹膜功能降低,最终引起腹膜超滤衰竭（ultrafiltration failure,UF）。CD105（endoglin,ENG）属于转化生长因子（transforming growth factor,TGF）结合蛋白,可分为 L-CD105（Long-CD105）及 S-CD105（Short-CD105）两种亚型,CD105被酶切后会以可溶性形式s-CD105（soluble-CD105）存在于血浆、尿液中。CD105在内皮细胞表面表达,也在心肌成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、肾脏成纤维细胞、肝星状细胞和门静脉成纤维细胞等细胞中表达。血管新生过程中,CD105可调节内皮细胞增殖和血管生成,可作为肝癌、肾癌、绒癌等肿瘤新生血管的标志物,与肿瘤的转移和侵袭密切相关。纤维化过程中,在心脏纤维化、心肌梗死、肝脏纤维化、皮肤纤维化模型中,CD105可促进细胞外基质蛋白的产生进而促进纤维化;然而,在小鼠的肾脏纤维化研究中发现,L-CD105的过表达可导致小鼠肾脏纤维化,而S-CD105的过表达可降低肾脏纤维化以及炎症反应,且该差异调节具有细胞特异性,提示CD105对纤维化的调节是可能基于不同刺激下、不同类型的细胞中L-CD105与S-CD105两种异构体存在的平衡及对TGF-β下游的信号通路不同调节方式。CD105在腹膜组织纤维化上的相关作用尚未有报道,本实验旨在探究CD105表达变化与腹膜透析患者腹膜纤维化、超滤功能的相关性,并对其有望在腹膜透析患者腹膜超滤衰竭中的作用进行展望。第一部分探究随着腹膜透析时间延长,腹膜形态结构及转运功能的变化目的:1.明确相比较于初始透析（对照组）,短程透析及PD超滤衰竭患者腹膜形态结构的变化。2.明确相比较于初始透析（对照组）,短程透析及PD超滤衰竭患者腹膜转运功能的变化。方法:1.腹膜组织的取材:选取初次置管进入腹膜透析的初始透析患者为对照组,记为Oday;选取两年以内因疝气、胸膜瘘、肾移植等原因行短程透析后退出腹膜透析的患者为短程透析组,记为＜2years;选取维持性腹膜透析六年及以上,最终因超滤衰竭而退出腹膜透析的患者为PD超滤衰竭组,记为≥6years。2.MASSON及HE染色观察患者腹膜形态结构的变化。3.收集2013-2021在山东省立医院肾内科住院行腹膜透析患者的临床资料、腹膜平衡试验及超滤量结果（初始透析的患者选取置管后一个月第一次行腹膜平衡试验的结果,短程透析及PD超滤衰竭患者选取拔管手术前最后一次结果进行分析）。4.统计学分析三组患者的临床资料、腹膜形态学改变、腹膜平衡试验及超滤量结果。结果:1.与Oday组比较,＜2years组PD患者腹膜增厚、胶原纤维增多（P＜0.05）;≥6years组PD患者腹膜较＜2years组、Oday组增厚最明显,胶原纤维增多最显著（P＜0.05）。2三组患者的年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）,4小时透析液肌酐与血液肌酐的比值（ratio of dialysate creatinine to blood creatinine,D/P Cr）、超滤量有统计学差异（P＜0.0001）。与 Oday 组 D/P Cr（0.64±0.05）比较,＜2years 组PD 患者 D/P Cr（0.73±0.07）增加,≥6years 组 PD 患者 D/P Cr（0.83±0.04）较＜2years组增加更加明显。与Oday组超滤量（858.33±90.03）比较,＜2years组PD患者超滤量（694.12±117.10）减少,≥6years 组 PD 患者超滤量（60.48±33.98）较＜2years组减少更加明显。结论:1.随着透析时间的延长,PD患者的腹膜逐渐增厚,腹膜纤维化逐渐加重。2.随着透析时间的延长,PD患者的腹膜超滤功能随着腹膜纤维化的加重而明显降低。第二部分腹膜CD105表达变化与腹膜纤维化、血管新生、腹膜转运功能的相关性的研究目的:1.明确初始透析、短程透析及PD超滤衰竭患者腹膜组织CD105、纤维化指标的表达变化,分析CD105表达与纤维化指标表达的相关性。2.明确初始透析、短程透析及PD超滤衰竭患者腹膜组织CD105、血管新生指标的表达变化,分析CD105表达与血管新生指标表达的相关性。3.分析CD105的表达与腹膜转运功能的相关性。方法:1.运用Western Blot检测三组患者腹膜组织CD105、纤维化相关因子TGF-β、间充质细胞样表型标志物α-SMA、N-cadherin、Vimentin、上皮标志物E-cadherin、血管内皮生成因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）A蛋白表达水平的变化。2.运用免疫组化检测三组患者腹膜组织CD105、纤维化相关因子TGF-β、间充质细胞样表型标志物α-SMA、VEGFA的表达水平的变化。3.运用RT-PCR检测三组患者腹膜组织CD105、VEGFA mRNA水平的表达。4.依据 Western Blot、RT-PCR 的结果,对 CD105 与 TGF-β、α-SMA、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、VEGFA的表达进行相关性分析。5.针对三组患者CD105及VEGFA的免疫组化染色情况,计算CD105及VEGFA的微血管密度（micro vessel density,MVD）,统计学分析二者的相关性。6.依据 Western Blot、RT-PCR、MVD 的结果,对 CD105 的表达与 4h D/P Cr值、超滤量进行相关性分析。结果:1.Wetern Blot结果显示,与Oday组相比较,＜2years组患者CD105、TGF-β、α-SMA、N-cadherin、Vimentin、VEGFA的表达明显升高（P＜0.05）,E-cadherin表达明显降低（P＜0.05）;≥6years组较＜2years组CD105、TGF-β、α-SMA、N-cadherin、Vimentin、VEGFA的表达升高更为显著（P＜0.05）,E-cadherin表达降低也更为显著（P＜0.05）。2.免疫组化结果显示,相比较于Oday组,＜2years组CD105、TGF-β、α-SMA、VEGFA的表达呈上升趋势（P＜0.05）;≥6years组较＜2years组上述指标的上升趋势更为明显（P＜0.05）。3.RT-PCR实验发现,相比较于Oday组,＜2years组CD105、VEGFA的表达明显增加（P＜0.05）;≥6years组较＜2years组CD105、VEGFA的表达增加更为显著（P＜0.05）。4.蛋白水平上,CD 105 的表达与 TGF-β（r=0.8879,P＜0.0001）、α-SMA（r=0.8330,P＜0.0001）、N-cadherin（r=0.8464,P＜0.0001）、Vimentin（r=0.8216,P＜0.0001）及VEGFA（r=0.8072,P＜0.0001）的表达呈现明显正相关,与E-cadherin（r=-0.6407,P=0.0008）的表达明显负相关;mRNA水平上,CD105的表达与VEGFA（r=0.8608,P＜0.0001）的表达呈现明显正相关。5.相比较于Oday组,＜2years组CD105与VEGFA的微血管密度呈现增加的趋势（P＜0.05）;≥6years组较＜2years组CD 105与VEGFA的微血管密度增加更为明显（P＜0.05）。CD105与VEGFA的MVD显著相关（r=0.8627,P＜0.0001）。6.CD105 在蛋白水平上（r=0.6464,P=0.0001）、mRNA 水平上（r=0.6945,P＜0.0001）、MVD（r=0.7297,P＜0.0001）的表达与4hD/P Cr值均呈现明显正相关;CD105在蛋白水平上（r=-0.7756,P＜0.0001）、mRNA水平上（r=-0.8299,P＜0.0001）、MVD（r=-0.9176,P＜0.0001）的表达与超滤量均呈现明显负相关。结论:1.CD105在腹膜纤维化发展中发挥促进作用。2.CD105在腹膜血管新生中发挥促进作用,CD105表达升高可导致腹膜血管新生明显增多。3.CD105表达升高通过腹膜纤维化、血管新生导致超滤衰竭。