目的骨巨细胞瘤作为亚洲人群多发的一种骨肿瘤,其对骨组织破坏能力强、致侵袭能力强、易复发、残率高且具有一定的转移性,寻找其骨侵蚀破坏的机制及新的治疗靶点成为该肿瘤的研究重点。目前关于骨巨细胞瘤的研究多为临床方面对术式的探索或病例回顾性研究,基础研究方面也多集中于破骨细胞的RNAK信号通路等,因此本研究将重点关注于剖析骨巨细胞瘤肿瘤组织细胞构成以实现对组织内细胞间异质性的分析,结合基因测序技术实现对肿瘤组织中造成骨侵蚀的多核破骨细胞样巨细胞与破骨细胞的分离,并对两者的差异表达基因进行生物学分析,探索对骨巨细胞瘤诊断治疗、预后评估及侵袭转移有重要影响的基因及其机制。方法本研究采用的测序方法为单细胞转录组测序技术,作为在二代测序技术上发展起来的新一代测序技术,单细胞测序可以实现组织内不同细胞单独分离、单独测序、单独建库的目标,同时也提高了基因表达水平测序的精确度,弥补了传统转录组测序方法中信号呈均值、易忽略少数细胞的不足之处,真正达到了在单个细胞水平上解析瘤内细胞异质性,为肿瘤的发生发展机制研究和诊疗方面开辟了新方向,提供了新思路。本研究将骨巨细胞瘤组织通过组织处理-组织解离-过滤检测的步骤将肿瘤组织处理至数量与活性均合格的细胞悬液并进行测序建库,对数据进行标准化过滤、线性转化、降维等处理,进行细胞聚类分析,将所有细胞按基因表达分类为12个细胞群。由于目前并没有关于单细胞测序技术在定义细胞类型上的明确方法,因此本研究在查询多个数据库及相关资料后,首次使用了在定义每个细胞群类型时,调取细胞差异表达基因并一一查询基因信息,同时通过采集数据库中细胞标记基因再对照本数据的查询定义方法,将12个不同细胞群分别进行定义命名,两种方向互相验证共同作用提高了严谨性及准确度,并填补了骨巨细胞瘤单细胞测序技术在定义细胞方法上的空白。在确定破骨细胞样巨细胞群和破骨细胞群后,本研究提取了这两个细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因,并对这些基因进行GO基因注释(分子功能+生物学功能)查询,寻找破骨细胞样巨细胞的过度骨吸收特性有关的重要基因。结果通过单细胞测序技术和生物学分析技术将肿瘤组织内细胞分群聚类后,确定了本研究所选取的骨巨细胞瘤中具有的细胞类型包括:NKT细胞、成骨细胞、浆细胞、B细胞、巨细胞、巨噬细胞、T细胞、基质细胞、单核细胞、破骨细胞、少量肌细胞、破骨细胞前体细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞。在确定细胞类型后,提取了破骨细胞样巨细胞和破骨细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因各50个,通过韦恩图比对发现两细胞群的差异表达基因中重合部分超过半数(27个),对这些功能同表达基因进行热图展示分析后,发现破骨细胞表达较高的基因包括CA2、ATP6V1E1、CKB、SPP1、ATP6V1C1、ATP6V1G1、GLRX、CSTB、ATP6V0E1、MATK、RAC2、SLC9B2、ATP6V1B2、CHCHD10、TCIRG1、ATP6V1H、ATP6V1F、RALA、ACP5、CTSD、CD68,而相比之下,共同基因中(50),巨细胞表达较高的基因包括TKT、SNX10、MMP9、CD84、RGS10、CTSK。对每个基因进行GO基因注释及查询后发现,在破骨细胞表达较高的基因中,基因SPP1除了正性调控骨吸收外,还参与了成骨细胞分化和骨化的过程,这是维持骨组织中成骨沉积-骨吸收稳态的重要环节,而巨细胞内SPP1的表达却较低。基因MATK参与了Erb B2(HER2基因)信号通路,而在研究中报道过骨肿瘤中的基因Erb B2的过表达伴有患者肺转移,也标志了较差的预后。在巨细胞表达较高的基因中,基因CTSK参与了负调控膜内骨化、骨吸收和软骨发育的生物学过程,这些功能可能是造成巨细胞骨破坏的机制,在研究中也报道过AKT/NFATc1/CTSK轴在颅骨发育过程中促进破骨细胞生成和骨吸收,而在骨巨细胞瘤中CTSK对于破骨细胞和骨吸收的机制并没有阐明。另一巨细胞表达较高的基因为基因SNX10,其生物学功能包括调节骨矿化、破骨细胞分化、骨吸收等与破骨细胞类功能,而且有研究显示基因SNX10参与破骨细胞激活,SNX10突变将造成破骨细胞功能障碍,进而影响骨质硬化,但基因SNX10在骨巨细胞瘤中对破骨细胞的作用机制并没有相应研究阐述。结论本研究通过对单细胞技术实验方法、数据的处理分析,定义细胞方法的探索和掌握,达到了对骨巨细胞瘤单个细胞层面和基因层面的剖析,分析定义了该肿瘤的所含细胞类型并初步确定了四个最可能造成肿瘤骨侵蚀特性的基因SPP1、MATK、CTSK和SNX10,弥补了当前骨巨细胞瘤研究领域的缺陷。