目的:结核分枝杆菌对乙胺丁醇产生耐药的临床特点以及耐药相关分子机制比较复杂,需要进一步研究,尤其是与耐药相关的基因突变也有待进一步发现。为此,本研究通过分析乙胺丁醇耐药的特点和产生的危险因素、耐药相关基因的突变方式以及突变可能引起的蛋白质功能变化、非编码区突变造成的二级结构改变等几个方面来更加全面的阐述结核分枝杆菌对乙胺丁醇产生耐药的机制。方法:1.临床回顾性分析研究选取了2129株临床结核分枝杆菌及其相应的结核病病例。人口学资料和菌株耐药性分析分为乙胺丁醇耐药组和敏感组,并分别比较两组的差异。乙胺丁醇耐药危险因素主要分析了不规则用药、药物副反应、原发耐药;与异烟肼和利福平耐药进行比较,重点比较了用药次数、用药时间和治疗方案这三个方面的不规则用药。2.耐药相关基因突变研究:选择了Rv0179c,Rv0026,Rv1058,Rv1699,Rv2807,Rv2947c,Rv3756c,Rv3877,Rv1080c-Rv1081c,Rv1482c-Rv1483,Rv2416c-Rv2417c,Rv3796-Rv3797,Rv2427c-Rv2428,Rv2733-Rv2734,Rv2754c-Rv2755c,Rv3428c-Rv3429,Rv3793-Rv3794,Rv3901c-Rv3902c,Rv3806,emb B,emb A,emb C和emb R,共23个基因。研究选取了183株EMB耐药菌株。提取183株EMB耐药结核分枝杆菌的DNA,分别用PCR方法扩增获取相应片段,并对这些片段分别测序两次,测序结果与H37Rv(ATCC 27294)比对,找到相关的突变位点,并查找氨基酸的变化形式。运用Predict SNP软件预测氨基酸的突变对蛋白质结构和功能的影响。通过H37Rv(ATCC 27294)密码子偏好库查找了同义突变密码子的偏好性变化。运用Gene Quest分析碱基突变前后非编码RNA结构的变化。结果:1.2129株临床菌株中,有228株对乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)耐药,耐药比例为10.71%;其中1130株是全敏感菌株,比例为53.08%。在228株EMB耐药菌株中,初治病例为181例(79.4%),复治为47例(20.6%);异烟肼(isoniazid,INH)耐药164株(71.9%),利福平(Rifampicin,RFP)耐药171株(75%),耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB)134株(58.8%)。比较EMB耐药组和EMB敏感组发现两者仅在初复治的比例方面存在显著差异(P=0.01),EMB耐药组中复治结核病人的比例高;而在病人年龄、性别、吸烟历史以及结核病合并其他疾病方面差异都不显著(P>0.05)。在EMB耐药菌的耐药谱方面:EMB耐药组平均对2种以上的抗结核药物耐药(2.19±0.10),EMB敏感组平均对0.79±0.04种药耐药,两组差异显著(P<0.001)。EMB耐药组中的MDR-TB所占的比例(58.8%)高于EMB敏感组(17.0%),二者差异极显著(P<0.001),这提示高比例的MDR-TB是EMB耐药组耐药谱广的主要原因。在EMB耐药性产生的危险因素方面:EMB耐药的主要危险因素是不规则治疗(47.25%),药物副反应(4.40%)和原发性耐药(48.35%)。从不规则治疗的次数来看,在耐药性产生之前EMB被使用过2.86±0.69次,较INH(1.67±0.88次)和RFP(1.39±0.61次)高,说明EMB反复使用较多次数之后才产生耐药性。从不规则药物治疗时间(少于6个月)来看,EMB产生耐药所需时间为5.0±0.94月,较INH(3.78±1.28月)和RFP(3.89±0.60月)时间长。而不规则药物治疗(6个月以上)中,EMB、INH和RFP三者产生耐药性所需的时间没有差异。2.在所有研究的基因中,Rv0026,Rv1058,Rv1699,Rv2807,Rv3756,Rv2416c-6Rv2417c,Rv3796-Rv3797,Rv2733-Rv2734,Rv2754c-Rv2755c和Rv3428c-Rv3429的碱基突变率分别为2.5%、1.25%、1.25%、2.5%、0、0、0、0、2.5%和1.25%,突变率很低,而且没有任何重复性。Rv0179c,Rv2947c和Rv3877突变较多。Rv0179c共有18个位点发生了碱基突变,分别是S102*、A198G、S214L、L215P、D236E、F254L、V62A、G164A、S166I、W167C、S169T、T170T、N182T、H183R、Q186R、K202E、G204A和Y227F,共有46株菌突变,占所分析160株EMB耐药菌株的28.75%。Rv2947c有D213G和P448S突变,共8株菌突变,占167株EMB耐药菌的4.79%。Rv3877有11个位点发生了碱基突变,分别是P39S、E45D、G370G、I439I、L454L、L88L、C203*、Q281H、I289T、A354A和S466S,总共突变16株菌,占所分析168株EMB耐药菌株的9.52%。基因芯片的生物信息学分析表明:在EMB刺激下,上述突变频率较高的三个基因的表达水平都显著增高;而那些突变频率很低的基因的表达水平则不受EMB刺激的影响。emb R、emb A、emb C、emb B、Rv3806基因的突变率分别是3.3%、3.8%、4.1%、74.17%、8.46%,其中emb R、emb A、emb C、Rv3806的突变菌株大多同时存在emb B基因突变。emb B基因有6个位点的突变,分别是emb B306、emb B328、emb B354、emb B406、emb B439、emb B497、emb B531,突变率分别为54.6%、1.8%、3.7%、31.7%、8.3%、5%。emb B306有6种碱基突变形式,3种氨基酸突变形式,分别是M306V>M306I>M306L,突变率为54.6%。emb B406有31.7%突变率,而且emb B406倾向于不与emb B306同时发生突变。通过预测以下氨基酸突变对蛋白质的结构和功能会有不良影响:emb R基因的P243S,emb A基因的L105V、R380P突变,emb B基因的M306L、D328H、G406D、Q497K、Q497R;Rv0179c基因的S166I、W167C、K202E、L215P、D236E、F254L突变;Rv2947c的D213G突变;Rv3877基因的P39S和I289T的突变。其余突变形式对蛋白质的结构和功能的影响为中性。有5个非编码区发生了较多且有重复性的突变,它们分别是Rv1080 cRv1081c(Rv1080c-Rv1081c)、Rv1482c-Rv1483、IG1872(Rv2427c-2428)、IG2934(Rv3793-Rv3794)和IG3021(Rv3901c-Rv3902c)。这些位点的突变会引起非编码RNA二级结构的改变。结论:1.EMB耐药在结核病临床中较为常见,其中原发性EMB耐药较多,其发生与病人年龄、性别、吸烟历史以及结核病合并其他疾病无显著关系。2.EMB耐药菌具有较广的耐药谱,其中MDR-TB菌占多数。3.临床中EMB和INH、RFP相比不容易产生耐药,表现在它在产生耐药前持续用药时间长且多次反复使用。4.研究的23个基因中,emb基因是EMB耐药中突变率最高的基因,其中又以emb B306密码子和emb B406密码子的突变率最高,且emb B406倾向于不与emb B306密码子同时发生突变(P=0.037)。5.实验筛选到Rv0179c、Rv2947c和Rv3877三个新基因在EMB耐药菌中存在较高的突变率。6.实验筛选到Rv1080c-Rv1081c、Rv1482c-Rv1483、IG1872(Rv2427c-Rv2428)、IG2934(Rv3793-Rv3794)、IG2991(Rv3862c-Rv3863)、IG3021(Rv3901c-Rv3902c),共5个非编码区在EMB耐药菌中存在较高的突变率,突变会造成非编码RNA二级结构的改变。7.突变有非同义突变(氨基酸突变)和同义突变。部分氨基酸突变较大地影响了蛋白结构和功能;同义突变使密码子的偏好性降低,从而对蛋白的合成造成影响,进而影响了耐药表型。