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法布雷疾病(Fabry disease;FD),是因GLA基因编码的α-半乳糖苷酶A缺失或完全丧失而导致的糖鞘脂类底物积累的先天性X连锁隐性遗传病。其发病症状随底物在患者体内积累部位的不同而异。男性患者发病严重,女性多为携带者且症状较轻。本课题为了进一步研究GLA基因突变导致FD的分子机制,构建了GLA野生型及突变体的细胞模型,并对新发突变位点进行了致病性研究,同时对突变体的结构及功能做了详细分析。1.首先对5个FD先证者进行了GLA基因的Sanger测序,确定突变位点分别为:c.119C>A、c.101A>G、c.680G>C、c.801+1G﹥A和c.280T﹥C,分析各个突变的研究进展,发现c.801+1G﹥A和c.280T﹥C两个突变位点为新发突变。因此,本研究主要围绕GLA基因突变c.801+1G﹥A和c.280T﹥C的致病机制进行研究。2.利用qRT-PCR技术检测患者血液中GLA基因mRNA的表达量。与正常人相比,患者体内GLA基因的表达量都有所下调且含有c.801+1G﹥A突变的患者下调更多。由于c.801+1G﹥A突变位点位于Intron 5第一位,可能影响前体mRNA的剪接。利用RT-PCR技术检测患者体内GLA基因的转录本。研究表明,患者体内除正常转录本外,还存在一个分子量较大的转录本,经测序分析,该转录本是在Exon 5和Exon6之间插入了36 bp的Intron 5所致;为了进一步阐明剪接异常是否由该突变导致,我们利用minigene技术转染HEK293T细胞来研究该突变对minigene基因转录的影响,结果在mRNA水平和蛋白水平均证明c.801+1G﹥A突变可以引起GLA基因mRNA的异常剪接。3.利用生物信息学、生物化学及细胞生物学的方法对突变体蛋白的结构和功能做进一步研究。通过序列同源性比对发现,这两个突变位点在不同物种中都高度保守;同源建模分析蛋白质的三级结构发现,c.801+1G﹥A(p.L268IfsX3)突变导致GLA酶活性区域严重受损,部分Domain 1(氨基酸残基269-330)及全部Domain 2(氨基酸残基331-429)的结构丢失;c.280 T﹥C(p.C94R)突变紧邻酶活性位点D92和D93,可能影响该酶与底物的结合,而且突变导致C94与C52形成的二硫键断裂,影响了蛋白质结构的稳定性。4.构建GLA-WT及GLA-MT的真核表达载体,通过细胞转染,免疫荧光技术检测发现,GLA c.801+1G﹥A突变体蛋白在细胞质内形成聚集体,并且呈斑点状不均匀分布。另外,与GLA-WT转染的细胞相比,c.801+1G﹥A突变体可以加速细胞衰老;c.280 T﹥C突变体在细胞内的定位虽无明显改变,但可导致细胞核发生皱缩;α-半乳糖苷酶酶活性分析显示,与GLA-WT相比,这两个突变体的酶活性均发生下调,且GLA c.801+1G﹥A突变体的酶活性下降更为显著。综上所述,本研究以法布雷患者血液为研究材料,利用Sanger测序技术检测到两个GLA基因的两个新发突变,应用生物信息学、分子生物学、生物化学及细胞生物学手段找到基因突变引起患者发病的分子机制,该研究成果将进一步丰富Fabry disease突变数据库并为FD的临床精确诊断提供理论依据。