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酶法合成母乳脂肪替代品是近年来的功能性油脂方面的研究热点,而sn-1,3专一性脂肪酶是其中的关键原料之一。然而,市场上sn-1,3专一性脂肪酶制剂非常有限且价格昂贵,需要在sn-1,3专一性脂肪酶的生产技术上获得突破,以获得低成本、高活力的脂肪酶制剂。本研究以提高sn-1,3专一性脂肪酶产量及降低其生产成本为目标,主要研究内容包括：1.从中国传统食品蒸饺的蒸笼屉中筛选产脂肪酶微生物,分离筛选21株产脂肪酶微生物。进一步筛选到1株脂肪酶高产菌株出芽短梗霉(Aureobasidium sp.) S4,通过响应面中心组合试验设计确定摇瓶发酵培养基,在该条件下脂肪酶酶活达到了31.75U/mL,较优化前提高到3.41倍。并对该脂肪酶sn-1,3专一性进行了鉴定。2.通过密码子优化改造了编码sn-1,3位置专一性TLL基因和RML基因,并将其克隆转化到Pichia pastoris表达系统进行重组表达。TLL重组菌株在摇瓶中发酵168 h得到的发酵液上清pNPP水解酶活为312.72 U/mL,比原始TLL基因重组菌酶活提高了74.29%。然而,RML重组毕赤酵母菌平均酶活仅为3.77 U/mL。3.含前导肽脂肪酶pTL的对应GS-pTL菌株的胞外脂肪酶表达水平(434.32 U/mL)显著高于不含前导肽的GS-TL和前导肽带Kex2位点的GS-kTL的对应值,表明TLL脂肪酶的5氨基酸前导肽能提高自身的表达水平。另外,提高前导肽疏水性的分子改造,突变体的重组菌株酶活(483.29 U/mL)较GS-pTL提高11.27%,表明pTL前导肽的疏水性有利于脂肪酶TLL的重组表达水平。RML脂肪酶潜在的Kex2酶切位点改造实验结果证明该位点并不影响RML的重组表达。4.对多种sn-1,3专一性脂肪酶同工酶共表达方式进行比较,从整体酶活上比较,Kex2介导的共表达结果最佳。Kex2介导的RML和kTL共表达脂肪酶菌株(GS--RMk-kTL)平均胞外为酶活306.91 U/mL,略大于单独表达RML和kTL脂肪酶酶活(分别为2.89和300.59 U/mL)及二者之和(303.48 U/mL),表明脂肪酶共表达同工酶可一定程度提高酶的表达水平。但由于RML酶活水平较低,限制了共表达对酶整体表达水平的提高效果。融合蛋白脂肪酶同工酶成功得到表达,但是由于结构受到影响因而酶活较低,显著低于单独的TLL的对应酶活。2A断裂肽能够在酵母中介导多蛋白共表达以及分泌,但是严重影响2A下游蛋白TL的表达量。5.在摇瓶水平对对毕赤酵母TLL重组工程菌产脂肪酶的表达条件进行了单因素优化,得到最高酶活2 265.3 U/mL。采用甲醇为唯一碳源进行重组酵母高密度发酵,脂肪酶酶活在发酵202 h后达到了最高的22 561.4 U/mL。参考摇瓶优化的结果,采用辅助碳源与甲醇共诱导发酵208h后发酵液上清的最高酶活为24 522.6 U/mL,较以甲醇为唯一碳源提高10.87%。利用大孔吸附树脂D3520固定化脂肪酶TLL,对固定化脂肪酶的OPO合成应用进行了研究。