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聚γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid,y-PGA）是一种天然的多功能生物高分子聚合物,但γ-PGA发酵原料成本高,限制了 y-PGA工业化运用。本研究以甘油为主要碳源,优化Bacillus licheniformis WX-02（简称WX-02）高产γ-PGA的发酵工艺,并进一步解析WX-02甘油代谢途径,在此基础上构建高效代谢甘油的工程菌株,以期高效利用粗甘油生产y-pGa。本研究首先利用高效液相色谱-蒸发光散射检测设备建立了甘油的分析方法,该方法简单快捷,测量精确。利用外标法定量,甘油浓度的对数与其峰面积的对数在一定范围内有良好的线性关系,相关系数为0.997;甘油检出限（S/N（?）3）为0.09 mg/mL;相对标准偏差为0.504%。以甘油为主要碳源,优化了 WX-02摇瓶发酵生产γ-PGA的培养基成分和发酵条件。最佳摇瓶发酵培养基为（g/L）:甘油70.0,谷氨酸钠30.0,硝酸钠15.0,柠檬酸钠 12.0,氯化铵 8.0,K2HPO4·3H2O 1.0,MgSO4·7H20 1.0,ZnS04·7H20 1.0,CaCl21.0,MnSO4·H2O0.15。摇瓶发酵条件:种龄9h,接种量3%。在该优化发酵工艺条件下,y-PGA产量可达35.46 g/L,合成速率为0.74 g/L/h,甘油利用率为67.3%,比优化前分别提高了 63.6%,64%和20.7%。在此基础上,利用生物柴油衍生的粗甘油为原料进行γ-PGA发酵,y-PGA产量可达33.25 g/L,合成速率达0.69 g/L/h。本文构建了呼吸途径中甘油激酶基因glpK和3-磷酸甘油脱氢酶基因glpD缺失菌株（WX-02△glpK和WX-02△glpD）以及发酵途径中甘油脱氢酶基因gldA,ybdH缺失菌株（WX-02△gldA,WX-02△ybdH,WX-02△ybdH△gldA）,二羟丙酮激酶基因dhaK缺失菌株（WX-02AdhaK）,将这些菌株分别在以甘油为唯一碳源的培养基中进行有氧和厌氧发酵。研究发现WX-02△glpK和WX-02△glpD在有氧和厌氧发酵环境下均不能生长;缺失甘油脱氢酶基因（gldA,ybdH）或二羟丙酮激酶基因（dhaK）,在有氧和厌氧条件下,对菌体的生长都没有明显的影响。表明WX-02中甘油的代谢是通过呼吸途径进行。分别构建了编码甘油转运协助蛋白基因glpF,甘油激酶基因glpK和3-磷酸甘油脱氢酶基因 glpD 过表达菌株 WX-02/pHY-glpF,WX-02/pHY-glpK,WX-02/pHY-glpD。WX-02/pHY-glpF的γ-PGA产量和甘油消耗量与WX-02/pHY300PLK对照菌株相当;而WX-02/pHY-glpK和WX-02/pHY-glpD菌株y-PGA产量分别比WX-02/pHY300PLK对照菌株提高了 19%和17%,甘油消耗量分别比对照菌株提高了 12%和 9.3%。通过同源重组,将来源于枯草芽胞杆菌168的组成型启动子P43和WX-02中ytzE基因启动子PytzE分别替换glpFK操纵子的启动子PglpFK,构建了 WX-02/P43glpFK和WX-02/PytzEglpFK工程菌株。在优化的发酵工艺条件下进行γ-PGA发酵,WX-02/P43glpFK甘油消耗量比野生菌株提高了 11.5%,γ-PGA产量与野生菌无明显差别,WX-02/PytzEglpFK甘油消耗量和γ-PGA产量相比于野生菌株分别提高了 20%和 5.6%。构建了 WX-02甘油激酶第230位组氨酸替换为精氨酸的突变菌株WX-02/glpKH230R,该菌株进行y-PGA发酵时,菌体无法生长。这与枯草芽胞杆菌甘油激酶230位组氨酸替换为精氨酸,其酶活提高的结果不一致。