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结核杆菌是结核病的病原菌。结核杆菌侵入机体进行繁殖，释放大量抗原尤其是蛋白抗原，选择性刺激B细胞丛产生大量免疫球蛋白，急性早期阶段以IgA、 IgM升高为主，此后IgG水平逐渐升高，升高的程度与病情轻重相关[1]。因此，检测体液中的抗结核抗体对结核病的诊断有重要的辅助作用。引起免疫反应的结核抗原多而复杂，为了寻找敏感性高特异性强的结核抗原，本实验利用基因工程技术重组结核分枝杆菌蛋白抗原，从结核分枝杆菌中提取菌体蛋白和脂多糖抗原，并对这些抗原进行抗原性分析。首先，从结核分枝杆菌标准株H37Rv中提取DNA作为模板，根据GenBank提供的蛋白基因序列设计引物，通过PCR法克隆38KDa和14KDa蛋白基因，利用表达载体PET-30a（＋）和PET-22b（＋）分别以包涵体和可溶性蛋白的形式表达该蛋白，再利用离子亲和层析方法对蛋白进行纯化，获得高纯度的目的蛋白，经Western Blot检测表明两种重组蛋白都具有良好的抗原性。其次，为了获得结核杆菌菌体蛋白和脂多糖抗原，利用改良的液体苏通培养基培养大量的结核分枝杆菌，收集菌体，冰浴超声破<WP=7>碎，用酚/氯仿抽提提取菌体蛋白，将其水相用氯仿/甲醇抽提除去残留的酚和脂质，再用DNase I 酶和RNase 酶作用除去DNA和RNA，得到初步提纯的脂多糖即LPS-1。 将LPS-1置于去污剂Triton-X114 中，分别在4℃和37℃条件下发生作用后，分成含有亲水性多糖AMS的水相即LPS-2和含有双极性甘露糖轭合物LAMS和LMS的有机相即LPS-3。最后，用PPD、重组38KDa、14KDa、ESAT-6蛋白、菌体蛋白等五种蛋白和三种脂多糖作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG作为第二抗体，按间接免疫原理，分别检测结核阳性和阴性血清参考品。结果显示，PPD、重组38KDa、14KDa、ESAT-6蛋白以及初步纯化的脂多糖LPS-1对结核血清参考品检测的敏感性分别为87.8％、80.5％、75.6％、96.0％、71.7％，特异性皆为96.0％。用菌体蛋白和LPS-3检测结核血清参考品的敏感性仅为24.4％和43.9％，略低于文献报道的结果。以LPS-2为抗原检测结核血清参考品，结果与文献报道一致。本实验从8种结核抗原中筛选出5种抗原性良好的抗原，为下一步制备结核金标检测试剂盒提供了实验基础。