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细胞壁是真菌维持细胞形态、细胞机械强度和渗透压完整性所必需的亚细胞结构。病原性真菌的细胞壁可以介导真菌对宿主的黏附,是影响其致病性的重要毒力因子之一。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞壁通常由β-葡聚糖、甘露糖蛋白以及少量几丁质组成。在酿酒酵母中大多数甘露糖蛋白被用于合成含糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)结构的GPI锚定蛋白(GPI-anchored proteins,GPI-APs),其中一部GPI-APs定位于细胞膜,另一部分GPI-APs被从细胞膜上释放并共价交联至细胞壁的β-1,6-葡聚糖上形成GPI-细胞壁蛋白(GPI-anchored cell wall proteins,GPI-CWPs)。已有研究报道Dfg5p和Dcw1p是一对同源的GPI-APs,推测它们以同工酶的形式参与GPI-APs从细胞膜交联至细胞壁的过程,但这它们的分子作用机制尚不清楚。本实验以酿酒酵母为模式菌株分析Dfg5p和Dcw1p在细胞壁合成过程中的功能,有助于理解真菌细胞壁的合成过程,为开发为开发针对GPI-CWP合成的抗真菌制剂提供新的研究方向。主要研究结果如下:本研究以酿酒酵母W303a为出发菌株构建MET3启动子调控的条件突变菌株KT2(dfg5?PMET3DCW1),在该条件突变菌株中当DCW1表达受到抑制时,细胞膜表面积累大量的Cwp1p(典型的GPI-CWP),而细胞壁中Cwp1p含量则显著降低。结果表明,在GPI-APs交联至细胞壁的β-1,6-葡聚糖的过程中Dfg5p和Dcw1p具有识别和切割GPI-APs的功能,可有效的将Cwp1p从细胞膜中释放出来。Dfg5p和Dcw1p属于糖苷水解酶76家族(Glycoside hydrolase 76,GH76)。氨基酸序列分析结果表明,该家族存在四个与甘露酶催化活性相关且高度保守的氨基酸位点。对Dfg5p作定点突变,产生的突变蛋白Dfg5W71Ap、Dfg5D122Ap、Dfg5D123Ap无法回补KT2条件突变菌株的生长缺陷,由此可以推测,Dfg5p具有至少甘露糖酶的活性,也可能具有转糖苷酶。本研究利用截除前导肽序列(Signal peptide sequence,ss)的DFG5基因片段表达了分泌至胞外的可溶性Dfg5p(Solube Dfg5,sDfg5p),该蛋白可回补KT2条件突变菌株的生长和细胞壁缺陷,说明GPI锚的修饰不影响Dfg5p的生物活性功能,sDfg5p仍可将GPI-APs并入细胞壁β-1,6-葡聚糖中。未来,sDfg5p可以用于体外研究进一步表征其甘露糖苷酶或转糖苷酶活性,也可作为筛选抗真菌药物的靶点蛋白。