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目的:为了提高双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)在体内的循环时间,达到较好的抗疟、抗肿瘤效果,合成以二硫键为连接臂,以十四胺、十八胺为载体修饰的双氢青蒿素前药(C14-SS-DHA、C18-SS-DHA);以碳碳键为连接臂,以十四胺、十八胺为载体修饰的双氢青蒿素前药(C14-CC-DHA、C18-CC-DHA)。通过考察四种双氢青蒿素前药制备的自组装纳米粒的制剂学特征、在大鼠体内的药动学特征、对约氏疟鼠的抗疟活性、对4T1细胞的增殖抑制作用、对4T1荷瘤小鼠的抗肿瘤活性,为小分子双氢青蒿素前药自组装纳米粒在治疗疟疾和抗肿瘤应用提供基础和指导。方法:1.四种双氢青蒿素前药的合成及表征以十四胺、十八胺、二硫代二丙酸、DHA、青蒿琥酯(Artesunate,AS)为原料药,发生脱水缩合反应、酯化反应、酰胺化反应合成四种双氢青蒿素前药。采用高分辨质谱(HR-MS)、氢谱(1H-NMR)对终产物的结构进行确证。2.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒制备及制剂学性质考察采用纳米沉淀法制备双氢青蒿素前药自组装纳米粒,以粒径和PDI为指标对处方进行单因素优化;并考察制备的双氢青蒿素前药自组装纳米粒的初步稳定性;建立高效液相-柱后衍生化法测定双氢青蒿素前药自组装纳米粒的包封率和载药量;应用小杯法评价四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒的体外释放行为。3.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒在大鼠体内的药动学研究DHA溶液和双氢青蒿素前药自组装纳米粒分别尾静脉注射至大鼠体内后于不同时间点取血,使用液液萃取法提取大鼠血浆的DHA及其前药。采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)法测定大鼠血浆中DHA和双氢青蒿素前药的含量。采用Kinetex?C8色谱柱,10 m M乙酸铵溶液∶乙腈=10∶90的流动相,青蒿素(Artemisinin,ART)为内标,在300μl/min的流速下使用ESI源以多反应监测的方式(MRM)进行阳离子监测,通过监测m/z 302.3→163.2(DHA),m/z 689.1→300.2(C14-SS-DHA),m/z 597.1→314.3(C14-CC-DHA),m/z 745.2→356.1(C18-SS-DHA),m/z 653.2→370.3(C18-CC-DHA),m/z 300.1→151.1(ART IS)确定DHA和前药的含量。应用统计矩方法,计算相关药动学参数。4.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒的体内抗疟活性建立约氏疟鼠模型,采用皮尔逊四天抑制给药法尾静脉注射给予五种剂量的DHA溶液和四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒溶液。停药1天,取血、涂片、染色、镜检,计算感染率、抑制率、ED50(50%有效剂量)、ED90(90%有效剂量)。停药7天,再次取血、涂片、染色、镜检,计算感染率。记录小鼠的存活天数。5.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒的体内外抗肿瘤活性评价以4T1细胞为模型细胞,采用MTT法对DHA溶液和四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒的细胞毒性进行初步研究。通过比较IC50结果对不同制剂的细胞毒性进行评价。以皮下接种4T1细胞的Balb/c鼠为模型动物,小鼠尾静脉注射DHA溶液和四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒溶液对其抗肿瘤活性进行研究。通过比较不同组小鼠的肿瘤生长曲线、小鼠体积变化及肿瘤负荷,评价各个制剂的抗肿瘤活性。结果:1.四种双氢青蒿素前药的合成和表征四种双氢青蒿素前药经HR-MS、1H-NMR验证,均成功合成。C14-SS-DHA为淡黄色粘稠的液体,产率为58%;C14-CC-DHA为白色块状固体,产率为75%,C18-SS-DHA为淡黄色蜡状固体,产率为61%;C18-CC-DHA为白色蜡状固体,产率为77%。2.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒制备及制剂学性质考察采用单因素优化后的处方分别制备四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒溶液,得到的自组装纳米粒呈类球形,分布均匀,粒径在100~140 nm之间,PDI均小于0.3,Zeta电位的绝对值在20~45 m V之间,包封率在93%~97%之间,载药量在79%~80%之间。稳定性实验说明四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒溶液在4℃环境下至少可稳定保存一个月。C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs中的前药在6个小时内累计释放量分别达到80.3%、79.2%、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs中的前药在6个小时内累计释放量分别达到72.9%、71.2%。C14-SS-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs在二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)存在的条件下,60 h内DHA的释放量分别达到40%、62%。3.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒在大鼠体内的药动学研究尾静脉注射DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs至大鼠体内后,血浆中DHA的血药浓度时间曲线下面积(AUC0-t)分别为:908.9±82.3、23211.5±9101.9、4221.5±540.0、748.7±221.7、13212.2±1765.1h·μg·L-1,AUC0-t的大小顺序为C14-SS-DHA NPs>C18-CC-DHA NPs>C14-CC-DHA NPs>DHA溶液>C18-SS-DHA NPs;MRT分别为:0.3±0.1、0.9±0.3、0.2±0.1、1.7±0.3、1.6±0.3 h,MRT的大小顺序是:C18-SS-DHA NPs≈C18-CC-DHA NPs>C14-SS-DHA NPs>DHA溶液≈C14-CC-DHA NPs。C14-CC-DHA NPs注射至大鼠体内未测到前药,C14-SS-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs在大鼠血浆中前药的AUC0-t分别为24179.2±1885.5、92525.3±25760.4、64123.3±14088.2 h·μg·L-1;MRT分别为0.8±0.1、1.1±0.3、1.3±0.4 h。4.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒的体内抗疟活性停药1天后,测得C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs的ED50值分别为:0.14±0.05、0.20±0.09、0.03±0.01、0.04±0.01μmol/kg与DHA组(0.87±0.27μmol/kg)相比均有统计学差异(P<0.05)。停药1周后,各组疟原虫的感染率均有所上升,但相比DHA溶液组,四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒给药组感染率上升速度较慢。各个浓度四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒给药组的平均存活时间均长于DHA溶液组。同一制剂给药组随着给药剂量的增加,疟原虫的感染率逐渐减低,有剂量依赖性。5.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒的体内外抗肿瘤活性评价DHA溶液组和四种双氢青蒿素自组装纳米粒给药组对4T1细胞的增殖抑制作用均随着药物浓度的增加和孵育时间的延长而增强,有剂量依赖性和时间依赖性。测得DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs与细胞共孵育48 h的IC50值分别为:2.60±0.22、2.05±0.05、2.52±0.20、3.43±0.10、3.86±0.10μmol/L。肿瘤生长曲线结果表明,相比Saline组,DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs组的肿瘤生长速度慢。Saline组、DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs组的肿瘤负荷分别为:(13.4±2.2)%、(7.8±0.67)%、(5.5±1.3)%、(9.4±0.5)%、(7.2±0.2)%和(5.9±0.6)%。结论:1.分别合成以二硫键或碳碳键为连接臂,以十四胺、十八胺为载体的四种双氢青蒿素前药。2.制备得到四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒,外观呈圆整的类球形,具有较小的粒径,较高的包封率和载药量,在4℃条件下可稳定保存一个月,在DTT存在的条件下,C14-SS-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs中的DHA有较快的释放。3.四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒大鼠尾静脉注射后,在不同程度上延长了DHA的平均滞留时间,提高了AUC,可能对该类药物的药效学有积极的作用。4.疟鼠尾静脉注射后,随给药剂量的增大,抗疟作用逐渐增强。四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒的抗疟活性均强于DHA溶液(P<0.05);同种连接臂的前药,十八胺为载体的前药自组装纳米粒有更好的抗疟活性;同种脂肪胺为载体的前药,含有二硫键的前药抗疟活性强于以碳碳键为连接臂的前药。5.不同的双氢青蒿素前药自组装纳米粒对4T1细胞的细胞毒作用随着给药剂量的增加、孵育时间的延长,而增大。同种连接臂的前药,十四胺修饰的双氢青蒿素前药自组装纳米粒对4T1细胞的抑制作用强于十八胺修饰的双氢青蒿素前药自组装纳米粒;同种脂肪胺为载体的前药,以二硫键为连接臂的双氢青蒿素前药自组装纳米粒的细胞毒性强于以碳碳键为连接臂的双氢青蒿素前药自组装纳米粒。四种双氢青蒿素前药自组装纳米粒对4T1荷瘤小鼠肿瘤的生长均有一定的抑制作用,其中C14-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs抗肿瘤效果最好。