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【研究背景和目的】上世纪70年代,Compagno教授即提出:“胰腺黏液性囊腺瘤随时间推移终将恶变”,表明侵袭潜能是胰腺肿瘤外分泌细胞先天的固有特性而非后天获得性表型。侵袭性胰腺黏液性囊腺癌(Mucinous Cystadenocarcinoma,MCC)患者5年生存率较差。近年来,自噬与肿瘤的关系在肿瘤研究领域已引起广泛关注。越来越多的研究证据发现自噬影响肿瘤的转移。现在认为自噬在肿瘤转移中发挥的作用是多方面的,取决于细胞类型、肿瘤微环境以及基因组状态。一方面自噬可通过阻断上皮间质转化和纤维化等抑制肿瘤转移;另一方面自噬亦可通过促进局部粘附、抗失巢凋亡和肿瘤间质代谢耦联来促进肿瘤转移。目前侵袭性胰腺MCC发生和发展的潜在分子机制研究较少,有待深入研究。鉴于与恶性侵袭相关的较低生存率,本课题主要以胰腺黏液性囊腺癌组织与胰腺黏液性囊腺癌细胞株(MCC1)为研究对象,检测胰腺黏液性囊腺癌状态下自噬活性变化,并揭示自噬对胰腺黏液性囊腺癌MCC1细胞恶性迁移和侵袭能力的影响,初步探讨可能的相关机制。【研究方法】1、采用免疫组织化学方法检测4对石蜡包埋的人胰腺黏液性囊腺癌组织和配对的癌旁组织自噬活性;体外培养人胰腺黏液性囊腺癌MCC1细胞以及正常胰腺导管上皮细胞HPDE,通过Western blot方法检测MCC1细胞和HPDE细胞中LC3-II和P62表达变化;最后通过细胞免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察MCC1细胞和HPDE细胞中的自噬小体数量。2、以胰腺黏液性囊腺癌MCC1细胞为研究对象,采用自噬诱导剂雷帕霉素(100μM)分别处理MCC1细胞,分为雷帕霉素处理4h组(4h组)和雷帕霉素处理6h组(6h组),以未予雷帕霉素处理的MCC1细胞为对照组(0h组),通过Western blot方法检测各组MCC1细胞中LC3-II和P62表达变化;然后采用Transwell小室迁移和侵袭实验检测自噬对MCC1细胞迁移和侵袭能力的影响。3、通过Real-time PCR技术检测0h组、4h组和6h组的MCC1细胞中miR-224-5p表达变化,同时比较MCC1细胞和HPDE细胞中miR-224-5p表达水平;然后采用慢病毒感染方法分别构建稳定过表达miR-224-5p(miR-224)及阳性对照组(NCm)MCC1细胞、稳定低表达miR-224-5p(inhibitor-224)及阴性对照组(NCi)MCC1细胞;通过Real-time PCR方法分别检测各组细胞中miR-224-5p表达水平;采用Western blot方法分别检测各组细胞中LC3-II和P62蛋白表达水平;通过细胞免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察各组细胞中的自噬小体数量;通过生物信息学软件TargetScan Human 7.2预测miR-224-5p调控MCC1细胞自噬的靶基因及结合位点;通过双荧光素酶报告基因方法验证miR-224-5p与预测靶基因BCL2的关系;采用Real-time PCR技术检测NCm、miR-224、NCi以及inhibitor-224组MCC1细胞中miR-224-5p和BCL2 mRNA相对表达水平;Western blot方法检测NCm、miR-224、NCi以及inhibitor-224组MCC1细胞中BCL2蛋白表达变化;采用细胞转染方法,在NCi和inhibitor-224组MCC1细胞中分别转染小干扰RNA BCL2(siBCL2)及阴性对照组(siNC)质粒,分为转染siNC的NCi组(NCi-siNC)、转染siNC的inhibitor-224组(inhibitor-224-siNC)、转染siBCL2的NCi组(NCi-siBCL2)和转染siBCL2的inhibitor-224组(inhibitor-224-siBCL2);最后通过Western blot方法分别检测各组MCC1细胞中BCL2、LC3-II和P62表达水平。【实验结果】1、与癌旁组织相比,人胰腺黏液性囊腺癌组织中LC3表达显著升高,而P62表达水平显著降低。与正常胰腺导管上皮细胞HPDE相比,胰腺黏液性囊腺癌MCC1细胞中LC3-II相对表达水平明显升高,P62相对表达则明显降低。免疫荧光结果发现MCC1细胞中明亮的LC3荧光小点数量明显多于HPDE细胞。2、Western blot结果发现,与0h组相比,4h组和6h组MCC1细胞中LC3-II相对表达水平均显著升高,且6h组LC3-II表达显著高于4h组。与0h组相比,4h组和6h组MCC1细胞中P62相对表达水平均显著降低,且6h组P62表达显著低于4h组。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示,6h组穿膜细胞数均明显高于0h组MCC1细胞。3、Real-time PCR结果显示,4h组和6h组MCC1细胞中miR-224-5p表达均显著高于0h组,且6h组miR-224-5p表达显著高于4h组MCC1细胞。同时,MCC1细胞中miR-224-5p相对表达水平显著高于HPDE细胞。与NCm组相比,miR-224组MCC1细胞中miR-224-5p相对表达水平显著增加;与NCi组相比,inhibitor-224组MCC1细胞中miR-224-5p相对表达显著减少。Western blot结果显示,与NCm组相比,miR-224组MCC1细胞中LC3-II相对表达水平显著升高,P62相对表达水平则显著降低;与NCi组比较,inhibitor-224组MCC1细胞中LC3-II相对表达明显降低,P62相对表达则明显升高。免疫荧光结果发现,相比较于NCm组,miR-224组MCC1细胞中明亮的LC3荧光小点数量显著增加;inhibitor-224组MCC1细胞中明亮的LC3荧光小点明显少于NCi组。生物信息学软件预测BCL2为miR-224-5p的靶基因。荧光素酶报告基因结果显示,与NCm组相比,转染BCL2 3’UTR报告基因的miR-224组MCC1细胞荧光素酶活性显著减少,而转染BCL2 3’UTR-Mutant报告基因的miR-224组MCC1细胞荧光素酶活性没有明显变化。与NCm组细胞相比,miR-224组MCC1细胞中BCL2 mRNA和蛋白的相对表达显著降低;与NCi组细胞相比,inhibitor-224组MCC1细胞中BCL2 mRNA和蛋白的相对表达明显升高。最后,Western blot结果显示,与NCi-siNC组相比,NCi-siBCL2组MCC1细胞中BCL2蛋白表达显著降低。与inhibitor-224-siNC相比,inhibitor-224-siBCL2组MCC1细胞中BCL2蛋白表达显著降低,且BCL2蛋白在NCi-siBCL2组和inhibitor-224-siBCL2组MCC1细胞中表达无明显差异。与NCi-siNC组相比,NCi-siBCL2组MCC1细胞LC3-II蛋白表达显著升高,P62蛋白表达显著降低。与inhibitor-224-siNC相比,inhibitor-224-siBCL2组MCC1细胞LC3-II蛋白表达显著升高,P62蛋白表达显著降低,且LC3-II和P62蛋白在NCi-siBCL2组和inhibitor-224-siBCL2组MCC1细胞中表达无明显差异。【结论】自噬在人胰腺黏液性囊腺癌组织和MCC1细胞中高度活化。高度活化的自噬活性可以以时间依赖性方式显著提高MCC1细胞中miR-224-5p的表达,且miR-224-5p通过靶向BCL2促进MCC1细胞自噬,我们认为自噬信号传导与miR-224-5p之间存在正反馈环,这促进了MCC1细胞的侵袭性迁移和侵袭。这是首次评估自噬在胰腺黏液性囊腺癌中作用的研究。