沉香性辛、苦,微温,具有行气止痛,温中止呕,纳气平喘的功效。白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg是我国沉香唯一植物来源,其药用部位为含有树脂的心材。白木香只有在受到外界伤害或刺激时才会产生沉香,并且自然状态下结香率低。由于长期以来人为的掠夺式砍伐导致白木香野生资源枯竭,白木香在1987年已经被列为中国珍稀濒危三级保护植物,1999年被国务院列入国家二级重点保护野生植物。因此,通过人工栽培、优良品种选育以及组织培养等手段对白木香野生资源进行保护已迫在眉睫。本论文主要进行组织培养和多倍体诱导研究,为保护白木香野生资源提供参考。1目的本课题进行白木香组织培养及多倍体诱导研究。一方面,通过组织培养技术建立无性繁殖体系,为解决白木香野生资源紧缺问题提供参考,并期望获得再生体系为结香机制、种质创新等研究提供实验平台。另一方面,以白木香种子、幼苗根尖和组培不定芽为实验材料进行多倍体诱导研究,以期获得染色体倍性变异的新种质。2方法2.1白木香组织培养研究以白木香叶片、幼苗根尖和带芽茎段为外植体,主要研究外源激素对愈伤组织诱导、不定芽分化、腋芽萌发、丛生芽诱导和生根诱导的影响。2.2白木香多倍体诱导研究以白木香种子、在体植株根部和组培不定芽为材料,用秋水仙素溶液(剂量和时间组合)处理进行多倍体诱导,通过流式细胞仪检测DNA含量进行染色体倍性分析。3结果3.1白木香组织培养研究3.1.1灭菌条件选择通过优化灭菌剂和灭菌时间,确定叶片外植体灭菌条件为0.1%HgCl2灭菌10min；根外植体灭菌条件为0.01%HgCl2灭菌3min。3.1.2愈伤组织诱导通过考察叶龄、外植体大小、外植体接种方式、光照和激素浓度及组合等因素水平对叶愈伤组织诱导的影响,获得最优诱导条件为：将12d‘叶龄的叶片剪成0.5cm2大小,以正面向上的方式接种在MS+2,4-D(0.5～1.5)mg.L-1+ZT(O.5～1.5)mg·L-1培养基中,黑暗培养,愈伤组织诱导率达100%。通过考察不同激素对根愈伤组织诱导的影响,发现2,4-D和6-BA组合(83.3%)比NAA和6-BA组合(53.3%)愈伤组织诱导率高,最优培养基为MS+2,4-D0.1mg·L-+6-BA0.1mg.L-1。3.1.3不定芽诱导通过对多种激素浓度及组合进行叶和根愈伤组织分化实验,暂时未能诱导获得不定芽。3.1.4丛生芽诱导带芽茎段外植体诱导腋芽萌发已在培养基1/2MS+6-BA0.5mg-L-1+NAA0.2mg·L-1上初步获得成功。以萌发腋芽为材料,研究不同激素条件对丛生芽诱导的影响,结果发现,在添加6-BA的MS培养基丛生芽诱导效果较好,而含KT的MS培养基未能诱导出丛生芽。随着培养基中6-BA浓度的升高(6-BA浓度从0.1mg·L-1到2.0mg·L-1),丛生芽增殖率先升高后下降,6-BA含量为0.5mg·L-1时有最大增殖率4.07。当6-BA浓度高于1.0mg·L-1时,不定芽基部明显膨大,产生较多愈伤组织,增殖率下降。添加NAA0.01mg·L-1可以促进丛生芽增殖,而浓度高至0.1mg·L-1时则抑制丛生芽增殖。培养基中添加活性炭可以控制丛生芽黄化现象,但同时使丛生芽增殖率降为0。3.1.5不定芽生根诱导两步生根法与一步生根法相比,具有较高生根率,生根诱导条件为：先将不定芽接种到含NAA1.0mg·L-1的1/2MS培养基中预培养7d,后转入无激素1/2MS培养基诱导生根,生根率达75%。2白木香多倍体诱导研究2.1种子多倍体诱导以种子为材料诱导多倍体植株实验中,不同处理均能诱导种子根尖和茎尖生长点膨大,其中以1.2%秋水仙素处理36h,种子发芽率最高可达10.5%,最终获得2棵正常生长植株,流式细胞仪倍性检测结果显示,其中多分枝植株染色体未发生变异,另外生长缓慢植株为二倍体和四倍体嵌合植株。嵌合体植株与对照植株相比在形态学上无明显差别。2.2根多倍体诱导幼苗根部经0.2%秋水仙素喷雾处理12h,根尖膨大并能继续生长。流式细胞仪检测结果显示,膨大根尖部位和膨大根尖伸长部位均发生染色体倍性变化。2.3组培不定芽多倍体诱导组培不定芽经过秋水仙素溶液浸泡处理后(浓度为0.4%和0.8%,处理时间为1d、2d和3d),获得生长速率减慢、叶片变黄变厚、茎段变粗的疑似多倍体芽。4本论文主要成果(1)以带芽茎段为外植体,建立并优化了白木香组织培养快速繁殖体系；(2)白木香多倍体诱导实验方面,种子经过秋水仙素处理,获得一棵嵌合体植株和一棵染色体未发生倍性变化的多分枝植株；在体植株根部经秋水仙素处理,获得嵌合多倍体根；组培不定芽经秋水仙素诱导获得形态疑似多倍体芽。