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动脉粥样硬化(Atherosclerosis)目前被大多数学者认为属于一种脂质代谢障碍相关的慢性炎症性血管病变,是导致临床中急性心肌梗死、脑梗死等血管阻塞性疾病的最主要病理生理基础之一。目前对于动脉粥样硬化斑块形成机制的认识基础是脂质沉积学说。参与病变血管动脉斑块形成的细胞,既包括原位血管的细胞,如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及脂肪细胞,还包括血管外细胞,如单核-巨噬细胞、淋巴细胞及嗜碱性粒细胞等。目前已有研究证据提示这些非血管原位细胞,如单核-巨噬细胞,在动脉斑块中进展中起着至关重要的作用。Ⅰ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor-1,FGFR1)属于FGFR家族一员,通过与成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)相互作用后二聚化,发生磷酸化激活后,通过细胞生物信号的级联反应,激活成纤维生长因子受体底物(FGF receptor substrate 2,FRS2),进而调控细胞中核心信号蛋白,如磷酸脂酶Cγ(phospholipase Cγ,PLCγ)等,影响着机体的生长发育、细胞增殖与存活、代谢调控等多方面的生长状态。目前为止,FGFR1的相互作用配体除最经典的FGFs,还有后来被发现的其他多种非经典配体,例如有神经细胞黏附分子、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)及肝素等。临床研究发现多种癌症发生中伴随着肿瘤组织内FGFR1过表达或突变激活,从而促进肿瘤血管形成和肿瘤快速发展;因此,FGFR1也被广泛认为是一类重要抗肿瘤药物靶标,目前已有三个FGFR1小分子抑制剂进入抗肿瘤2期临床试验阶段。近年来,FGFR1在非肿瘤疾病的研究进展陆续受到关注。值的注意的是,FGFR1在动脉粥样硬化性疾病中的具体作用以及作用机制,却鲜有报道。但是,近期研究结果提示,FGFR1很可能也是动脉粥样硬化的潜在调控位点。在小鼠动脉粥样硬化模型中FGFR1被发现高表达于病变血管;进一步研究发现,FGFR1特异性抑制剂SU5402干预经典的动脉粥样硬化动物模型(载脂蛋白E敲除小鼠,ApoE-/-小鼠),动脉斑块的进展得到控制。在本研究中,我们通过构建在体ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型和离体的巨噬细胞泡沫化模型,尝试研究FGFR1在动脉粥样硬化形成的作用,并探讨可能的信号传导通路。本研究将分三部分内容从不同角度进行阐述。第一部分动脉粥样硬化中FGFR1异常表达目的:明确FGFR1在动脉粥样硬化中FGFR1的表达及分布。方法:通过高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导ApoE-/-小鼠形成动脉粥样硬化模型,以低脂饮食(low fat diet,LFD)喂养ApoE-/-小鼠作为对照。相应饮食喂养的ApoE-/-小鼠16周后处死后取主动脉,运用Western Blot和免疫组化方法检测小鼠动脉p-FGFR 1和FGFR1的蛋白水平;利用组织动脉冰冻切片做FGFR1与CD31/CD68/α-SMA的荧光双染观察FGFR1在各细胞中的表达水平;采用密度梯度离心法从动脉粥样硬化患者和正常人群的外周血获取单个核细胞,分别提取mRNA与总蛋白,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测FGFR1的mRNA水平,Western Blot检测细胞FGFR1的蛋白水平。结果:Western Blot实验提示相较于LFD小鼠,HFD组ApoE-/-小鼠主动脉中FGFR1磷酸化激活水平明显升高;组织免疫荧光实验也提示HFD组ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化血管中高表达FGFR1的巨噬细胞的细胞百分比显著升高;高表达FGFR1的内皮细胞数量显著下降;高表达FGFR1的平滑肌细胞数目在两组间无明显差异。此外,动脉粥样硬化患者的单个核细胞中FGFR1蛋白和mRNA水平相较于正常人群均显著升高。结论:动脉粥样硬化病变血管及外周单个核细胞中FGFR1激活水平显著提高,并且巨噬细胞FGFR1的高表达可能和动脉粥样硬化的病理生理过程相关。第二部分 FGFR1抑制剂有效缓解高脂喂养ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发展目的:观察FGFR1抑制剂对高脂喂养ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发展的影响。方法:借助高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠构建血管粥样硬化模型,并给予一定剂量(10mg/kg/天或20mg/kg/天,隔天一次)的FGFR1抑制剂AZD4547灌胃治疗,16周后处死小鼠取主动脉,运用油红O染色法检测小鼠胸腹主动脉动脉整体斑块形成情况;运用免疫组化方法和RT-PCR检测小鼠动脉脂肪酸转运蛋白(CD36)的蛋白表达和mRNA水平;通过RT-PCR检测小鼠动脉中白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在转录水平的变化;通过免疫组化检测小鼠主动脉中IL-6、TNF-α和CD68表达水平,评估血管炎症和巨噬细胞浸润水平;利用二氢乙啶(DHE)染色与3-硝基酪氨酸(3-NT)免疫组化染色观察小鼠动脉氧化应激水平。结果:与单纯高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠,高脂喂养的同时接受FGFR1抑制剂AZD4547干预的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积减少,血管CD36和CD68表达降低,炎症因子表达减少,动脉氧化应激水平减轻。结论:FGFR1抑制剂AZD4547可降低炎症与氧化反应,并显著缓解高脂喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展,说明了 FGFR1可能通过介导炎症与氧化应激调控动脉粥样硬化病程的发生与发展。第三部分FGFR1在巨噬细胞中的作用及机制研究目的:观察FGFR1在巨噬细胞中的作用和机制探讨。方法:提取原代巨噬细胞(MPM)并培养,利用FGFR1抑制剂AZD4547预处理,ox-LDL刺激15分钟后,裂解细胞并提取总蛋白,Western Blot检测p-FGFR1、FGFR1的表达;siRNA干预沉默凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(Lectin Like Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor 1,Lox-1),ox-LDL 刺激 15 分钟后,裂解细胞并提取总蛋白,检测p-FGFR1、FGFR1的表达;ox-LDL刺激24小时后,运用油红O染色法检测细胞脂质堆积程度;运用免疫荧光方法、细胞流式检查和Western Blot检测巨噬细胞的CD36表达;siRNA干预沉默FRS2和PLCy或通过过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARy)激动剂罗格列酮和抑制剂GW9662调控PPARγ激活水平,随后ox-LDL刺激巨噬细胞,免疫荧光方法检测脂质堆积,RT-PCR和ELISA检测细胞炎症因子(IL-6和TNF-α)的mRNA和蛋白分泌水平,二氢乙锭(DHE)和2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCF-DA)染色法检测巨噬细胞炎症反应与氧化应激。结果:ox-LDL干预可诱导巨噬细胞FGFR1的磷酸化激活及脂质堆积;FGFR1抑制剂AZD4547预处理后,ox-LDL对巨噬细胞FGFR1的磷酸化降低;siRNA抑制Lox1表达后,ox-LDL对FGFR1的磷酸化作用被阻断。通过siRNA抑制CD36表达或用AZD4547干预后,结果显示巨噬细胞脂质堆积程度降低。通过siRNA抑制FRS2、PLCy和用PPARy的激动剂和抑制剂预处理后,结果显示抑制PPARy可降低巨噬细胞脂质堆积。通过siRNA抑制PLCγ、FRS2、PPARy和用PPARy的激动剂和抑制剂预处理后,结果显示抑制PLCγ可有效降低细胞炎症反应和氧化应激。结论:FGFR1抑制剂AZD4547可降低巨噬细胞的细胞炎症、氧化反应与脂质堆积,并且FGFR1可能通过PLCγ介导ox-LDL诱导巨噬细胞的炎症反应与氧化应激,并通过PPARγ/CD36介导ox-LDL诱导巨噬细胞的脂质堆积。