毕赤酵母因其在蛋白表达方面的明显优势,被广泛用于工业生产和实验室研究。近年来,随着合成生物学的发展,已有多种药用化合物或中间体在毕赤酵母中成功合成(如6-甲基水杨酸、土曲霉酸、洛伐他汀等),证明了以毕赤酵母为底盘细胞进行异源多酶途径组装从而合成目标分子的应用潜力。由于游离质粒在毕赤酵母中不能稳定存在,外源基因大多只能通过整合到基因组的方式进行表达。但毕赤酵母同源重组效率低,且筛选标记较少,在复杂遗传线路设计和多酶途径组装时存在设计难度大、构建周期长等问题,限制了毕赤酵母的研究和应用。Vogl课题组通过大量实验探索,在毕赤酵母CBS7435菌株中建立了 CRISPR/Cas9基因编辑技术,实现了目标基因的敲除和突变,并开发了一种筛选标记循环回收使用的方法。此外,一些其他的筛选标记回收方法或多表达盒装载质粒构建方法在毕赤酵母中得以开发应用。但是,在组装复杂生物合成途径时,菌株构建周期长、设计难度大等问题仍难以解决。本文针对该问题开发了一套高效、无筛选标记的多基因一步整合方法,为毕赤酵母的基因敲入及重组表达菌株设计提供了新的方法和思路。首先,同源重组在DNA修复的竞争中处于劣势,Cas9产生的双链断裂通过非同源末端修复机制(NHEJ)修复的概率较大,因此弱化NHEJ是提高同源重组效率的有效方法。KU70是细胞内NHEJ的关键基因。此前研究报道中,KU70基因的缺失能够显著提高外源基因同源重组的效率。因此,本课题利用CRISPR/Cas9方法在毕赤酵母GS115中敲除KU70,并采用YPD培养基培养使带有Cas9编码基因、gRNA及选择标记基因的质粒丢失,由此获得非同源末端修复功能缺陷菌株Δku70,该菌株为组氨酸(His)缺陷型菌株。之后采用靶向GUT1的gRNA在Δku70缺陷株中进行基因敲除实验,结果表明相对于野生型GS115,Δku70中同源重组的效率明显提升。因此,将Δku 70缺陷株作为后续研究的母本菌株。其次,在外源基因敲入过程中,整合位点的选择非常重要,整合位点不应影响毕赤酵母菌株正常的生长代谢。本文选取毕赤酵母中已鉴定的启动子上游或终止子下游序列作为基因整合位点,最大限度地保证基因组内源表达盒不受影响。在启动子PTEFI-a、PFLD1、PAOX1、PGAP上游及终止子AOXTT下游100 bp范围内设计了10个gRNA靶点,并采用eGFP作为报告蛋白,验证不同gRNA靶点的同源重组效率,最终筛选到了一系列高效的整合位点。其中,pAOX1up-g2靶点的效率为94.7%,pTEF1 up-g1靶点的效率为95.8%,FLD1up-g1靶点的效率为91.7%。然后,进行多基因一步整合方法的探索。为了避免染色体重排造成的影响,所选位点应尽量分布在不同的染色体上。根据初步验证的同源重组效率,pAOX1up-g2、pTEF1up-g1、pFLD1up-g1靶点效率较高,且分别位于4号、1号、3号染色体上。将其进行组合,以eGFP、mCherry为报告蛋白,验证双位点一步整合的效果,效率最高可达65%。以eGFP、mCherry及BFP为报告蛋白,验证三位点一步整合的效果,效率可达20%。上述实验证明了 CRISPR/Cas9技术在毕赤酵母中可以介导多个供体DNA片段进行多位点一步整合。最后,为验证多基因一步整合方法的实用性,选择真菌聚酮活性产物土曲霉酸的生物合成途径进行检验。以中间体6-甲基水杨酸、3-甲基邻苯二酚作为目标产物,采用多位点一步整合法在毕赤酵母中组装合成途径。将筛选到的重组菌株进行摇瓶培养,萃取产物进行HPLC检测分析。结果表明,采用多基因一步整合法获得的重组菌株均能成功异源合成目标产物,证明本方法具有良好的应用潜力和实用价值。此外,上述重组菌株通过YPD培养基培养均能实现使带有Cas9编码基因、gRNA及选择标记基因的质粒丢失,从而完成筛选标记的回收,验证了无筛选标记整合的可行性。综上,本研究构建了一系列可用于单位点整合或多位点一步整合的通用载体工具,可以实现在毕赤酵母底盘宿主中基因的无标记高效整合及多个表达盒的一步整合,大幅度缩短了构建周期,降低了设计难度,为毕赤酵母表达系统的应用和研究提供了新的方法与思路。