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第一部分小鼠关节软骨来源祖细胞的提取与鉴定目的:从小鼠关节软骨中分离培养关节软骨来源祖细胞(Articular Cartilage-derived Progenitor Cells,ACPCs),观察 ACPCs 的细胞形态,鉴定其增殖、分化能力及表面标志物,探究小鼠ACPCs的细胞特性,为软骨组织工程提供合适的种子细胞。方法:无菌条件从5天龄,雄性C57BL/6小鼠各关节中获得软骨组织,以Ⅳ型胶原酶消化6-8h,获得细胞悬液。采用纤连蛋白分黏附分选法获得小鼠ACPCs。流式细胞术鉴定其表面标志物表达。待细胞长至80%行倒置显微镜观察其细胞形态;克隆形成实验评估其增殖能力;三系诱导检测细胞多系分化能力。结果:倒置显微镜观察显示小鼠ACPCs呈中间宽两边细长的短梭形,其形态与间充质细胞类似。流式细胞鉴定,CD29、CD73表达分别为(89.2±1.53)%和(81.1±0.84)%;CD90、CD105 分别为(24.3±1.11)%和(41.6±0.62)%;Notch-1表达为(12.0±1.05)%;CD31、CD44、CD45表达分别为低表达或不表达。克隆形成实验显示小鼠ACPCs可形成多个单细胞克隆簇。成骨诱导条件有钙结节产生;成脂诱导条件有大量脂滴产生;成软骨诱导条件细胞团块HE染色有软骨陷窝产生,周围有大量细胞外基质。结论:运用纤连蛋白分选从小鼠关节软骨中成功获得ACPCs,其具有三系分化潜能。第二部分小鼠ACPCs的增殖和成骨、成软骨分化能力研究目的:评价不同代次小鼠ACPCs的增殖和成骨、成软骨分化能力的差异,以及探索小鼠ACPCs的有效增殖及分化诱导方案。方法:取不同代次(P0、P1、P2代)小鼠ACPCs和不同碱性成纤维生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)浓度(0 ng/mL、2 ng/mL 和 5 ng/mL)增殖培养条件下的P1代小鼠ACPCs,应用克隆形成实验和细胞增殖实验比较ACPCs的增殖能力;对其成骨诱导,采用茜素红S染色和RT-PCR检测成骨相关基因(Osteocalcin、AKP、Runx2)检测成骨潜能改变;对其成软骨诱导,进行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和RT-PCR检测成软骨相关基因(COMP、SOX9、Aggrecan、COL-Ⅱ)表达检测成软骨潜能改变。结果:(1)不同代次的小鼠ACPCs在形态上未有明显改变,细胞密度随着细胞代次增加降低。CCK-8和克隆形成实验结果显示随着细胞代次增加,ACPCs增殖能力降低。茜素红S染色和RT-PCR结果显示随着细胞代次增加,ACPCs成骨潜能降低。HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和RT-PCR结果显示,随着细胞代次的增加,ACPCs成软骨潜能未改变。(2)小鼠ACPCs的细胞形态随着bFGF浓度的升高由短梭形细胞变为两端细长的长梭形细胞,细胞密度在含有2 ng/mL bFGF浓度时最高。CCK-8和克隆形成实验结果显示2 ng/mL bFGF浓度时,ACPCs增殖能力相对最强。茜素红S和RT-PCR结果显示随着bFGF浓度的升高,ACPCs成骨潜能降低。HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、RT-PCR结果显示,2 ng/mL bFGF浓度时,ACPCs成软骨潜能相对最强。结论:小鼠ACPCs的增殖能力和成骨分化能力随着细胞代次的增加而降低,但成软骨分化能力未有明显下降;含有2ng/mL bFGF的α-MEM培养条件是一个相对合适的细胞扩增方案,能够有效促进ACPCs的扩增及维持成软骨潜能。第三部分小鼠ACPCs体内稳定性及抗血管化研究目的:研究小鼠ACPCs构建的软骨组织在体内的稳定性及阿西替尼对软骨组织的抗血管化作用。方法:取在含2 ng/mL bFGF的α-MEM完全培养基培养条件的P2代小鼠ACPCs,按照以下方式处理:(1)构建软骨细胞团块,诱导组(A组)经过3周体外成软骨诱导培养,对照组(B组)经过3周体外高糖标准培养基培养;(2)实验组(C组)以含阿西替尼的Gelatin-PCL静电纺丝材料作为支架,对照组(D组)以单纯Gelatin-PCL静电纺丝材料作为支架,应用“三明治模型”构建细胞材料复合物,体外成软骨诱导3周。将所有组植入BALB/C裸鼠背部皮下,A组和B组在术后第2、4、6周分别取出,C组和D组在术后6周取出,分别行HE、番红O-快绿染色及Ⅱ型胶原、X型胶原、VEGF-A免疫组化染色。结果:(1)B组细胞团块植入体内2周时开始出现软骨陷窝消失和软骨内骨化,且随着植入时间的延长骨化部位越来越多,最终整个细胞团块发生骨化。A组在体内2周时无骨化,在体内6周时出现软骨组织结构破坏并发生软骨内骨化。A组和B组中Ⅱ型胶原随着体内植入时间的增加而逐渐减少;X型胶原随着体内植入时间的增加逐渐增多;VEGF-A随着体内植入时间的延长而增加,在钙化组织周围有明显聚集。(2)HE染色和番红O-快绿染色结果显示D组在体内6周出现软骨内骨化,而C组在体内6周依然维持稳定的软骨表型;Ⅱ型胶原在C组高表达,D组无明显表达;X型胶原免疫组化在C组和D组中均有阳性区域;VEGF-A在D组钙化区域周围有阳性表达,在C组软骨组织内无阳性表达。结论:小鼠ACPCs在体外构建稳定的软骨组织后植入体内会产生软骨内骨化,软骨内骨化原因可能与血管形成有关;VEGF-A受体抑制剂阿西替尼在体内可以抑制小鼠ACPCs组织工程软骨的骨化。