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Ⅰ黄酮类化合物对CYP3A4的激活作用及分子机制研究
黄酮类化合物是一类由植物经光合作用产生的低分子量天然产物，具有二苯基色元酮的基本结构，在蔬菜、水果、中草药中均有分布，具有广泛的药理活性，如抗氧化，降血脂，调节心脑血管系统，清除自由基等。近年来，随着现代医学的发展，黄酮类化合物由于广泛的药理活性引起了药物研究者的广泛关注，它们与药物合用的现象越来越普遍，这就大大增加了食物-药物、药物-药物相互作用(DDI)发生的可能性。在代谢型DDI的发生过程中，药物代谢酶和转运体介导的DDI是两个重要的调控机制，即一种外源性物质通过调控药物代谢酶或转运体的活性，引起同服药物的血药浓度的改变，可能出现毒性反应或者药效降低的现象。由于药物代谢酶和药物转运体在外源物的代谢中占主导作用，且二者底物存在交叉性，因此外源物与药物代谢酶/转运体的相互作用已成为现代医学研究的重点之一。
细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是人体主要的Ⅰ相代谢酶，主要分布在肝脏、肾脏和小肠等组织中，可代谢药物、食物等外源性物质，也可代谢胆汁酸、激素等内源性物质。CYP3A4是CYP450超家族中最重要的同工酶，可代谢近50％的临床用药，其活性改变可引起DDI的发生。CYP3A4酶活性改变的调控机制包括诱导、抑制和激活。CYP3A4的诱导和抑制作用已有大量文献报道，而激活作用由于体内外相关性差，分子机制尚不明确，在研究中经常被忽略，但激活作用的生物学效应却不容忽视，可导致活性或毒性代谢物的生成量增加，从而影响药物的有效性和安全性。因此本研究重点关注黄酮类化合物对CYP3A4的激活作用并探讨其分子机制。
本研究应用人肝微粒体和过表达CYP3A4的HepG2(CYP3A4-HepG2)细胞模型研究食物和中草药中富含的75种黄酮类化合物对CYP3A4活性的影响，并在细胞及整体动物水平评价激活的生物学效应，应用分子对接和圆二色谱技术从蛋白质结合氨基酸种类和相互作用作用力的差异及二级构象的改变等不同角度进行激活作用机制的探讨。最后采用药效团模型及ADMETPredictor自建模型总结了黄酮类化合物的结构与CYP3A4激活作用的构效关系，为预测临床食物-药物相互作用提供依据。研究结果表明:
1.75种黄酮类化合物对CYP3A4活性的激活作用及生物学效应
1.1.人肝微粒体体外初筛结果发现，在75个化合物中有8个化合物对CYP3A4具有较强的激活作用(激活率≥50％)，包括艾黄素、α-奈黄酮、桔皮素、6-甲基黄酮、6-羟基黄酮、β-奈黄酮、5-羟基黄酮和黄酮;8个化合物对CYP3A4具有较弱的激活作用(激活率20-50％)，包括3-羟基黄酮、7-羟基黄酮、川陈皮素、甜橙素、白杨素、高良姜素、异橙黄酮和异泽兰黄素;剩余59个化合物对CYP3A4无明显激活作用(激活率＜20％)。
1.2.在人肝微粒体中对激活率高于50％的化合物进行了CYP3A4激活强度EC50的测定，结果表明，在人肝微粒中对CYP3A4激活活性最强的是艾黄素(EC50=2.17μM)，其次是α-奈黄酮(EC50=3.12μM)，桔皮素(EC50=3.22μM)，6-甲基黄酮(EC50=4.10μM)，6-羟基黄酮(EC50=6.10μM)，β-奈黄酮(EC50=6.42μM)，5-羟基黄酮(EC50=7.99μM)和黄酮(EC50=9.22μM)。
1.3.激活作用具有底物依赖性，首先选择了三个临床常用的CYP3A4底物药物卡马西平、黄独素B和决奈达隆在细胞水平进行激活作用的生物学效应评价，结果表明决奈达隆适合作为目标药物，且其最适温孵浓度为10μM，最适温孵时间为6h。
1.4.在CYP3A4-HepG2细胞中，黄酮类化合物对CYP3A4激活作用的生物学效应评价结果表明，桔皮素、甜橙素、黄酮和6-羟基黄酮通过激活决奈达隆的代谢使其细胞毒性减轻，细胞存活率提高。
1.5.激活作用除了具有底物依赖性，还具有明显的种属差异，经过大鼠、小鼠、金黄地鼠肝微粒体的体外筛选，发现黄酮类化合物只有在金黄地鼠肝微粒体中对CYP3A4的激活作用与人肝微粒体中相似，因此最终选择金黄地鼠作为激活作用的体内评价模型。
1.6.金黄地鼠体内，黄酮类化合物对CYP3A4激活作用的生物学效应评价结果表明，金黄地鼠提前30min分别口服给予桔皮素、甜橙素、黄酮或6-羟基黄酮后，与决奈达隆单独给药组相比，决奈达隆的体内代谢被激活，主要代谢物N-脱丁基决奈达隆的AUC0-t和Cmax均不同程度增加，增加倍数分别为2.36～2.87倍和1.57～～2.71倍。
1.7.中成药蛇胆陈皮散富含能激活CYP3A4作用的黄酮类化合物桔皮素和甜橙素，在金黄地鼠体内其与决奈达隆联合应用后，蛇胆陈皮散不影响决奈达隆的代谢，提示临床合用时可能无明显的代谢型药物相互作用，可能是在研究剂量下蛇胆陈皮散中桔皮素和甜橙素的含量没有达到激活的浓度，也可能是由于蛇胆陈皮散中的蛇胆成分或其他成分中和了桔皮素和甜橙素的激活作用所致。。
2.黄酮类化合物对CYP3A4激活作用的分子机制和构效关系研究
2.1.黄酮类化合物与CYP3A4的分子对接结果表明，桔皮素、甜橙素、黄酮和6-羟基黄酮主要通过疏水性范德华力和Pi键与CYP3A4结合，Cys442是这4个黄酮与CYP3A4相互结合共同的氨基酸残基，提示Cys442可能是黄酮类化合物激活CYP3A4的关键结合位点。
2.2.黄酮类化合物与CYP3A4相互作用的圆二色谱研究表明，桔皮素、甜橙素、黄酮和6-羟基黄酮激活CYP3A4活性的分子机制，是使CYP3A4的二级结构改变，且α-螺旋含量增加，β-转角含量降低，即α/β值增大，从而使CYP3A4蛋白构象更加稳定。
2.3.3D-QSAR药效团计算结果表明，黄酮类化合物的B芳香环，7位疏水性作用基团以及4位的氢键受体是激活作用的必需药效团，可为黄酮类化合物的结构改造提供依据。
2.4.应用ADMETPredictor建立2D-QSAR模型，训练集和测试集的Q2均大于0.7，且模型预测性良好，可对未进行检测的化合物进行CYP3A4激活活性的预测。
综上所述，本研究对75种日常饮食及中草药中富含的黄酮类化合物进行了CYP3A4的激活作用研究以及体外和体内激活效应生物学评价，建立了金黄地鼠体内激活作用评价模型，并应用分子对接和圆二色谱技术初步阐明了分子机制。最后构效关系模型的建立可为预测临床食物-药物相互作用的发生提供实验依据，并为后续激活作用的研究提供参考。
Ⅱ黄酮类化合物对P-糖蛋白的抑制作用及构效关系研究
P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是人体主要的外排转运蛋白之一，可将毒物、药物等外源物排出细胞，发挥机体屏障的作用。P-gp主要分布在肝脏、肾脏、小肠以及某些特殊的生理屏障如血脑屏障和胎盘屏障的毛细血管内皮细胞上。因此对于P-gp的底物药物，P-gp的活性改变可能会引起其血药浓度的变化，对于治疗窗口窄的药物而言，体内血药浓度的微小波动可能就会导致毒性反应的发生或临床疗效的改变。除正常组织外，P-gp还在肿瘤细胞过表达，这也是肿瘤药物多药耐药的主要原因之一。因此抑制P-gp的活性可能会改善多药耐药现象。
本研究应用实验室前期自建的人源化P-gp过表达MDR1-MDCKⅡ细胞模型研究日常饮食及中草药中富含的75种黄酮类化合物对P-gp活性的影响，在细胞水平评价调控作用的生物学效应，并观察对紫杉醇多药耐药的改善。应用大鼠体内模型评价黄酮类化合物对地高辛药代动力学的影响。通过分子对接探讨调控作用的可能机制。最后，建立药效团模型总结黄酮类化合物对P-gp调控作用与结构的关系，为预测临床DDI的发生提供实验依据。
1.75种黄酮类化合物对P-糖蛋白的抑制作用及药物相互作用研究
1.1.MDR1-MDCKⅡ细胞双向转运实验结果表明，6个化合物对P-gp的转运活性有显著的抑制作用(抑制率≥50％)，包括川陈皮素、异橙黄酮、桔皮素、甜橙素、金松双黄酮和千层纸素A;23个化合物对P-gp转运活性的抑制作用较弱(抑制率20-50％)，其余46个化合物对P-gp的转运活性无明显影响(抑制率＜20％)。
1.2.抑制率高于50％的化合物进行P-gp抑制活性IC50的测定，结果表明，在MDR1-MDCKⅡ细胞中，川陈皮素对P-gp转运活性的抑制作用最强(IC50=2.21μM)，其次是异橙黄酮(IC50=4.2μM)，桔皮素(IC50=12.66μM)，甜橙素(IC50=18.9μM)，金松双黄酮(IC50=53.42μM)和千层纸素A(IC50=78.33μM)。
1.3.在MDR1-MDCKⅡ细胞中，黄酮类化合物对P-gp抑制作用的生物学效应评价结果表明，异橙黄酮、桔皮素、甜橙素、金松双黄酮和千层纸素A分别与百草枯温孵后，百草枯的细胞毒性增大，尤其是千层纸素A和金松双黄酮，在百草枯750μM时，其细胞毒性分别增加了54.51％和59.65％。
1.4.抑制P-gp转运活性可改善多药耐药现象，在MX-1和紫杉醇耐药MX-1/T细胞中，上述6种黄酮均使紫杉醇的细胞毒性增大，尤其是桔皮素和金松双黄酮与紫杉醇温孵后，紫杉醇在耐药MX-1/T细胞中毒性比在野生型MX-1细胞中更强，提示黄酮类化合物通过抑制P-gp的转运活性可在一定程度上改善肿瘤药物多药耐药的现象。
1.5.SD大鼠体内，黄酮类化合物对P-gp抑制作用的生物学效应评价结果表明，SD大鼠提前30min分别口服上述6种黄酮类化合物后，地高辛的AUC0-t和Cmax与地高辛单独给药组相比均不同程度升高，其中川陈皮素作用最强，分别升高2.03倍和4倍。
1.6.中成药蛇胆陈皮散和银杏叶片分别富含能抑制P-gp活性的黄酮类化合物川陈皮素、桔皮素、甜橙素及金松双黄酮，在SD大鼠体内其与地高辛联合应用后，蛇胆陈皮散和银杏叶片均不影响地高辛的血药浓度，提示在临床合用中可能无明显的代谢型药物相互作用。
2.黄酮类化合物对P-糖蛋白抑制作用的分子机制和构效关系研究
2.1.黄酮类化合物与P-gp分子对接结果表明，上述6种黄酮类化合物与P-gp对接后的空间构象与底物地高辛不同，且结合的氨基酸种类和数量以及相互作用力存在差异，且抑制作用可能与Pi键的形成有关，而非氢键。
2.2.3D-QSAR药效团计算结果表明，黄酮类化合物的B芳香环，6位、7位和4位的疏水性作用基团以及4位的氢键受体是抑制作用的必需药效团，可为黄酮类化合物的结构改造提供依据。
综上所述，本研究在稳定的实验条件下系统地探讨了75种日常饮食及中草药中富含的黄酮类化合物对P-糖蛋白的抑制作用，在MDR1-MDCKⅡ细胞、紫杉醇耐药MX-1/T细胞以及大鼠体内水平研究了抑制作用引起的DDI，并应用分子对接初步阐明了抑制作用的分子机制，最后应用药效团计算软件建立了构效关系模型。上述研究可为预测临床中富含黄酮类化合物的食物-药物相互作用的发生提供实验依据，并为开发改善肿瘤多药耐药的低毒高效的P-糖蛋白抑制剂提供思路。
黄酮类化合物是一类由植物经光合作用产生的低分子量天然产物，具有二苯基色元酮的基本结构，在蔬菜、水果、中草药中均有分布，具有广泛的药理活性，如抗氧化，降血脂，调节心脑血管系统，清除自由基等。近年来，随着现代医学的发展，黄酮类化合物由于广泛的药理活性引起了药物研究者的广泛关注，它们与药物合用的现象越来越普遍，这就大大增加了食物-药物、药物-药物相互作用(DDI)发生的可能性。在代谢型DDI的发生过程中，药物代谢酶和转运体介导的DDI是两个重要的调控机制，即一种外源性物质通过调控药物代谢酶或转运体的活性，引起同服药物的血药浓度的改变，可能出现毒性反应或者药效降低的现象。由于药物代谢酶和药物转运体在外源物的代谢中占主导作用，且二者底物存在交叉性，因此外源物与药物代谢酶/转运体的相互作用已成为现代医学研究的重点之一。
细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是人体主要的Ⅰ相代谢酶，主要分布在肝脏、肾脏和小肠等组织中，可代谢药物、食物等外源性物质，也可代谢胆汁酸、激素等内源性物质。CYP3A4是CYP450超家族中最重要的同工酶，可代谢近50％的临床用药，其活性改变可引起DDI的发生。CYP3A4酶活性改变的调控机制包括诱导、抑制和激活。CYP3A4的诱导和抑制作用已有大量文献报道，而激活作用由于体内外相关性差，分子机制尚不明确，在研究中经常被忽略，但激活作用的生物学效应却不容忽视，可导致活性或毒性代谢物的生成量增加，从而影响药物的有效性和安全性。因此本研究重点关注黄酮类化合物对CYP3A4的激活作用并探讨其分子机制。
本研究应用人肝微粒体和过表达CYP3A4的HepG2(CYP3A4-HepG2)细胞模型研究食物和中草药中富含的75种黄酮类化合物对CYP3A4活性的影响，并在细胞及整体动物水平评价激活的生物学效应，应用分子对接和圆二色谱技术从蛋白质结合氨基酸种类和相互作用作用力的差异及二级构象的改变等不同角度进行激活作用机制的探讨。最后采用药效团模型及ADMETPredictor自建模型总结了黄酮类化合物的结构与CYP3A4激活作用的构效关系，为预测临床食物-药物相互作用提供依据。研究结果表明:
1.75种黄酮类化合物对CYP3A4活性的激活作用及生物学效应
1.1.人肝微粒体体外初筛结果发现，在75个化合物中有8个化合物对CYP3A4具有较强的激活作用(激活率≥50％)，包括艾黄素、α-奈黄酮、桔皮素、6-甲基黄酮、6-羟基黄酮、β-奈黄酮、5-羟基黄酮和黄酮;8个化合物对CYP3A4具有较弱的激活作用(激活率20-50％)，包括3-羟基黄酮、7-羟基黄酮、川陈皮素、甜橙素、白杨素、高良姜素、异橙黄酮和异泽兰黄素;剩余59个化合物对CYP3A4无明显激活作用(激活率＜20％)。
1.2.在人肝微粒体中对激活率高于50％的化合物进行了CYP3A4激活强度EC50的测定，结果表明，在人肝微粒中对CYP3A4激活活性最强的是艾黄素(EC50=2.17μM)，其次是α-奈黄酮(EC50=3.12μM)，桔皮素(EC50=3.22μM)，6-甲基黄酮(EC50=4.10μM)，6-羟基黄酮(EC50=6.10μM)，β-奈黄酮(EC50=6.42μM)，5-羟基黄酮(EC50=7.99μM)和黄酮(EC50=9.22μM)。
1.3.激活作用具有底物依赖性，首先选择了三个临床常用的CYP3A4底物药物卡马西平、黄独素B和决奈达隆在细胞水平进行激活作用的生物学效应评价，结果表明决奈达隆适合作为目标药物，且其最适温孵浓度为10μM，最适温孵时间为6h。
1.4.在CYP3A4-HepG2细胞中，黄酮类化合物对CYP3A4激活作用的生物学效应评价结果表明，桔皮素、甜橙素、黄酮和6-羟基黄酮通过激活决奈达隆的代谢使其细胞毒性减轻，细胞存活率提高。
1.5.激活作用除了具有底物依赖性，还具有明显的种属差异，经过大鼠、小鼠、金黄地鼠肝微粒体的体外筛选，发现黄酮类化合物只有在金黄地鼠肝微粒体中对CYP3A4的激活作用与人肝微粒体中相似，因此最终选择金黄地鼠作为激活作用的体内评价模型。
1.6.金黄地鼠体内，黄酮类化合物对CYP3A4激活作用的生物学效应评价结果表明，金黄地鼠提前30min分别口服给予桔皮素、甜橙素、黄酮或6-羟基黄酮后，与决奈达隆单独给药组相比，决奈达隆的体内代谢被激活，主要代谢物N-脱丁基决奈达隆的AUC0-t和Cmax均不同程度增加，增加倍数分别为2.36～2.87倍和1.57～～2.71倍。
1.7.中成药蛇胆陈皮散富含能激活CYP3A4作用的黄酮类化合物桔皮素和甜橙素，在金黄地鼠体内其与决奈达隆联合应用后，蛇胆陈皮散不影响决奈达隆的代谢，提示临床合用时可能无明显的代谢型药物相互作用，可能是在研究剂量下蛇胆陈皮散中桔皮素和甜橙素的含量没有达到激活的浓度，也可能是由于蛇胆陈皮散中的蛇胆成分或其他成分中和了桔皮素和甜橙素的激活作用所致。。
2.黄酮类化合物对CYP3A4激活作用的分子机制和构效关系研究
2.1.黄酮类化合物与CYP3A4的分子对接结果表明，桔皮素、甜橙素、黄酮和6-羟基黄酮主要通过疏水性范德华力和Pi键与CYP3A4结合，Cys442是这4个黄酮与CYP3A4相互结合共同的氨基酸残基，提示Cys442可能是黄酮类化合物激活CYP3A4的关键结合位点。
2.2.黄酮类化合物与CYP3A4相互作用的圆二色谱研究表明，桔皮素、甜橙素、黄酮和6-羟基黄酮激活CYP3A4活性的分子机制，是使CYP3A4的二级结构改变，且α-螺旋含量增加，β-转角含量降低，即α/β值增大，从而使CYP3A4蛋白构象更加稳定。
2.3.3D-QSAR药效团计算结果表明，黄酮类化合物的B芳香环，7位疏水性作用基团以及4位的氢键受体是激活作用的必需药效团，可为黄酮类化合物的结构改造提供依据。
2.4.应用ADMETPredictor建立2D-QSAR模型，训练集和测试集的Q2均大于0.7，且模型预测性良好，可对未进行检测的化合物进行CYP3A4激活活性的预测。
综上所述，本研究对75种日常饮食及中草药中富含的黄酮类化合物进行了CYP3A4的激活作用研究以及体外和体内激活效应生物学评价，建立了金黄地鼠体内激活作用评价模型，并应用分子对接和圆二色谱技术初步阐明了分子机制。最后构效关系模型的建立可为预测临床食物-药物相互作用的发生提供实验依据，并为后续激活作用的研究提供参考。
Ⅱ黄酮类化合物对P-糖蛋白的抑制作用及构效关系研究
P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是人体主要的外排转运蛋白之一，可将毒物、药物等外源物排出细胞，发挥机体屏障的作用。P-gp主要分布在肝脏、肾脏、小肠以及某些特殊的生理屏障如血脑屏障和胎盘屏障的毛细血管内皮细胞上。因此对于P-gp的底物药物，P-gp的活性改变可能会引起其血药浓度的变化，对于治疗窗口窄的药物而言，体内血药浓度的微小波动可能就会导致毒性反应的发生或临床疗效的改变。除正常组织外，P-gp还在肿瘤细胞过表达，这也是肿瘤药物多药耐药的主要原因之一。因此抑制P-gp的活性可能会改善多药耐药现象。
本研究应用实验室前期自建的人源化P-gp过表达MDR1-MDCKⅡ细胞模型研究日常饮食及中草药中富含的75种黄酮类化合物对P-gp活性的影响，在细胞水平评价调控作用的生物学效应，并观察对紫杉醇多药耐药的改善。应用大鼠体内模型评价黄酮类化合物对地高辛药代动力学的影响。通过分子对接探讨调控作用的可能机制。最后，建立药效团模型总结黄酮类化合物对P-gp调控作用与结构的关系，为预测临床DDI的发生提供实验依据。
1.75种黄酮类化合物对P-糖蛋白的抑制作用及药物相互作用研究
1.1.MDR1-MDCKⅡ细胞双向转运实验结果表明，6个化合物对P-gp的转运活性有显著的抑制作用(抑制率≥50％)，包括川陈皮素、异橙黄酮、桔皮素、甜橙素、金松双黄酮和千层纸素A;23个化合物对P-gp转运活性的抑制作用较弱(抑制率20-50％)，其余46个化合物对P-gp的转运活性无明显影响(抑制率＜20％)。
1.2.抑制率高于50％的化合物进行P-gp抑制活性IC50的测定，结果表明，在MDR1-MDCKⅡ细胞中，川陈皮素对P-gp转运活性的抑制作用最强(IC50=2.21μM)，其次是异橙黄酮(IC50=4.2μM)，桔皮素(IC50=12.66μM)，甜橙素(IC50=18.9μM)，金松双黄酮(IC50=53.42μM)和千层纸素A(IC50=78.33μM)。
1.3.在MDR1-MDCKⅡ细胞中，黄酮类化合物对P-gp抑制作用的生物学效应评价结果表明，异橙黄酮、桔皮素、甜橙素、金松双黄酮和千层纸素A分别与百草枯温孵后，百草枯的细胞毒性增大，尤其是千层纸素A和金松双黄酮，在百草枯750μM时，其细胞毒性分别增加了54.51％和59.65％。
1.4.抑制P-gp转运活性可改善多药耐药现象，在MX-1和紫杉醇耐药MX-1/T细胞中，上述6种黄酮均使紫杉醇的细胞毒性增大，尤其是桔皮素和金松双黄酮与紫杉醇温孵后，紫杉醇在耐药MX-1/T细胞中毒性比在野生型MX-1细胞中更强，提示黄酮类化合物通过抑制P-gp的转运活性可在一定程度上改善肿瘤药物多药耐药的现象。
1.5.SD大鼠体内，黄酮类化合物对P-gp抑制作用的生物学效应评价结果表明，SD大鼠提前30min分别口服上述6种黄酮类化合物后，地高辛的AUC0-t和Cmax与地高辛单独给药组相比均不同程度升高，其中川陈皮素作用最强，分别升高2.03倍和4倍。
1.6.中成药蛇胆陈皮散和银杏叶片分别富含能抑制P-gp活性的黄酮类化合物川陈皮素、桔皮素、甜橙素及金松双黄酮，在SD大鼠体内其与地高辛联合应用后，蛇胆陈皮散和银杏叶片均不影响地高辛的血药浓度，提示在临床合用中可能无明显的代谢型药物相互作用。
2.黄酮类化合物对P-糖蛋白抑制作用的分子机制和构效关系研究
2.1.黄酮类化合物与P-gp分子对接结果表明，上述6种黄酮类化合物与P-gp对接后的空间构象与底物地高辛不同，且结合的氨基酸种类和数量以及相互作用力存在差异，且抑制作用可能与Pi键的形成有关，而非氢键。
2.2.3D-QSAR药效团计算结果表明，黄酮类化合物的B芳香环，6位、7位和4位的疏水性作用基团以及4位的氢键受体是抑制作用的必需药效团，可为黄酮类化合物的结构改造提供依据。
综上所述，本研究在稳定的实验条件下系统地探讨了75种日常饮食及中草药中富含的黄酮类化合物对P-糖蛋白的抑制作用，在MDR1-MDCKⅡ细胞、紫杉醇耐药MX-1/T细胞以及大鼠体内水平研究了抑制作用引起的DDI，并应用分子对接初步阐明了抑制作用的分子机制，最后应用药效团计算软件建立了构效关系模型。上述研究可为预测临床中富含黄酮类化合物的食物-药物相互作用的发生提供实验依据，并为开发改善肿瘤多药耐药的低毒高效的P-糖蛋白抑制剂提供思路。