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泛素蛋白酶体系统是真核生物内由泛素介导的极其复杂且高度特异的蛋白降解途径,它能够介导细胞内绝大多数蛋白质的降解,该系统参与细胞众多生理过程,如细胞生长和分化、细胞周期的调节、DNA修复、免疫反应以及细胞凋亡等。泛素蛋白酶体系统的功能紊乱会引发人类许多严重的疾病,某些关键酶的异常与肿瘤的形成和发展更是有密切的关系。在本团队前期B7-H4分子的研究中,我们发现表皮生长因子EGF刺激或表达EGF受体(EGFR)激活型突变体后B7-H4蛋白表达有明显上调,但转录水平并未出现与之一致的趋势。此外有相关研究发现EGFR被激活后调控的下游蛋白质组中包含大量的信号蛋白,泛素化以及去泛素化酶,转运蛋白和转录翻译相关的蛋白等,加之本实验室先前的免疫共沉淀结果的佐证,B7-H4的互作蛋白中的确有许多与泛素-蛋白酶体相关的分子,这提示我们B7-H4在细胞内很有可能也是由该系统调控表达的。在此基础上我们研究发现了在体内B7-H4确实存在泛素调控,在细胞水平下EGF刺激或者表达EGFR激活型突变体的情况下通过免疫共沉淀,免疫杂交等手段检测了B7-H4分子上的泛素水平的变化,表明EGF通路确实可以改变其泛素水平进而改变其蛋白水平。此外我们利用本实验室构建的B7-H4-3XFlag质粒和8种编码人类的泛素特异性蛋白酶质粒进行共转染,再通过免疫共沉淀方法发现其中USP2对B7-H4的泛素水平有显著作用。在此基础上我们通过过表达结合免疫共沉淀的方法发现USP2和B7-H4在细胞内存在一定的相互作用。本论文主要包括以下两部分内容:一、EGFR激活型突变体通过增强B7-H4稳定性而提高B7-H4蛋白水平[目的]研究B7-H4是否存在泛素调控,以及EGFR通路是否会调控B7-H4的泛素化修饰。[方法]使用泛素蛋白酶体抑制剂MG132处理H23、A549和293T细胞,检测B7-H4的蛋白表达;构建Flag标签的B7-H4真核表达载体,通过聚乙烯亚胺(PEI)向293T细胞中转染EGFR突变体、B7-H4和泛素质粒,24-48h后提取总蛋白,免疫共沉淀法富集B7-H4蛋白分子,检测分子上泛素水平的变化。[结果]成功构建了 Flag标签的B7-H4质粒;多种细胞中B7-H4在MG132的作用下均出现不同程度的上调;共同转染EGFR激活型突变体和B7-H4质粒进行免疫共沉淀后,B7-H4的泛素水平也出现了下调。[结论]确定了 B7-H4在细胞内确实受泛素系统调控;EGFR激活型突变体对B7-H4的上调很有可能是通过改变B7-H4的泛素修饰水平而提高其稳定性来实现。二、去泛素化酶USP对B7-H4的调控及相互作用的鉴定[目的]寻找能够特异性去除B7-H4分子上泛素的相关去泛素化酶DUB,并验证两种分子存在细胞内相互作用。[方法]通过在细胞内转染相关去泛素化酶质粒检测内源和外源B7-H4的表达来初步筛选出可能和B7-H4存在相互作用的DUB,再通过免疫共沉淀检测对应的DUB是否对B7-H4的泛素水平产生影响,最后再次利用正向和反向的免疫共沉淀鉴定两种蛋白是否有相互作用。[结果]Western blot和免疫共沉淀结果发现,在几种DUB中USP2细胞内过表达后能够显著降低B7-H4分子上各种类型的泛素水平,并且进一步的正反向的免疫共沉淀也均显示两种蛋白存在细胞内相互作用[结论]USP2能够调控B7-H4的泛素水平,USP2可能是一种能够特异性调节B7-H4蛋白的DUB