论文部分内容阅读
第一部分ZNF521过表达对急性髓细胞白血病细胞系的作用和机制研究研究背景急性髓细胞白血病,又称急性非淋巴细胞白血病,是一种起源于骨髓造血干、祖细胞的恶性程度很高的血液疾病。在我国,急性髓细胞白血病是成人中最常见的白血病类型,发病率随年龄增长而增加,进展迅速,自然病程仅为数月。白血病的发生是由多种基因异常及表观遗传学改变参与的多步骤过程,其具体的分子机制十分复杂,至今仍不能得到清楚阐述。已有大量研究表明,转录因子调控机制异常所导致的骨髓多能造血干细胞不能分化为功能正常的各系血细胞,是白血病发生的重要原因。近年来,锌指蛋白521(ZNF521)作为一种参与造血调控的重要转录因子,其在造血干细胞干性维持、调控造血干细胞分化方向中的作用逐渐得到重视。更值得关注的是,在大多数的AML患者中发现有ZNF521的高表达。同时,ZNF521高表达与特定的基因异常呈显著正相关,特别是MLL基因重排。这些研究说明,ZNF521可能与白血病的发生有密切关系,但其在白血病发挥怎样的作用、具体的作用机制如何还不清楚。因此,深入研究ZNF521对急性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡等表型的影响,明确其下游的分子靶点,对于进一步阐明急性髓细胞白血病的发病原因,丰富其治疗手段具有重要的意义。研究目的1.构建含人ZNF521基因的重组慢病毒载体p CDH-puro-ZNF521,将其与慢病毒空载体p CDH-puro分别包装慢病毒,并感染人急性髓细胞白血病细胞系K562和THP-1,用Western Blot和Real-Time PCR检测各细胞系中ZNF521过表达情况。建立可稳定过表达ZNF521基因的ZNF521-K562和ZNF521-THP-1稳转细胞系。同时用p CDH-puro空载体包装慢病毒建立NC-K562和NC-THP-1稳转细胞系作对照组。2.检测ZNF521过表达对急性髓细胞白血病细胞系THP-1和K562增殖和凋亡的影响。3.通过检测ZNF521下游与细胞增殖和凋亡有关的基因,探讨ZNF521过表达对K562、THP-1的增殖和凋亡表型产生影响的可能作用机制。研究方法1.扩增库存p Tango-zeo-N4Flag-ZNF521质粒。通过NCBI查询ZNF521 cds序列,确认p Tango-zeo-N4Flag-ZNF521表达的是人ZNF521蛋白亚型1。运用Vector NTI设计引物对目的基因片段N4Flag-ZNF521进行PCR扩增,引物的5’端和3’端分别引入Nhe I、Swa I酶切位点,Nhe I、Swa I双酶切后连接入p CDH-puro慢病毒载体,转化感受态大肠杆菌DH5α、挑取阳性克隆,抽提质粒并做酶切鉴定,得到p CDH-puro-ZNF521慢病毒质粒。将其与p CDH-puro慢病毒载体与包装质粒ps PAX2、p MD 2.G共转染HEK293T细胞,得到含ZNF521基因的慢病毒颗粒及对照慢病毒颗粒。2.将上述得到的Vector、ZNF521慢病毒感染K562及THP-1细胞。将细胞分为:Vector-K562,即感染对照组慢病毒的K562细胞系;ZNF521-K562,即感染含ZNF521基因的慢病毒载体的K562细胞系;Vector-THP-1,即感染对照组慢病毒的THP-1细胞系;ZNF521-THP-1,即感染含ZNF521基因的慢病毒载体的THP-1细胞系。感染时加用2ug/ml嘌呤霉素进行筛选,常规传代换液,5天后观察细胞活力及状态以初步确定感染是否成功。同时收集各组细胞的RNA和蛋白,采用Real Time PCR和Western Blot检测各组细胞ZNF521的m RNA及蛋白表达上调情况,最终确定感染是否成功。3.用CCK-8细胞增殖试剂盒检测ZNF521过表达细胞系与对照组在细胞增殖上的差异,用Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡的差异。4.应用实时定量PCR及Western Blot检测ZNF521过表达细胞系中c-myc的表达变化。研究结果1.成功构建含人ZNF521基因的慢病毒载体p CDH-puro-ZNF521,并成功建立可稳定过表达ZNF521基因的稳转细胞系ZNF521-THP-1和ZNF521-K562,以及对照组细胞系Vcetor-K562和Vector-THP-1。2.CCK-8细胞生长曲线表明,ZNF521过表达组与对照组相比增殖明显加快,3.流式检测表明ZNF521过表达组与对照组相比凋亡水平无明显差异。4.ZNF521-THP-1和ZNF521-THP-1稳转细胞系中c-myc在m RNA和蛋白水平均表达上调。结论ZNF521过表达可促进急性髓细胞白血病细胞系THP-1和THP-1细胞系的增殖,但对凋亡无明显影响。其促增殖作用可能是通过调控c-myc的表达来实现的。第二部分CD11b表达水平对急性髓细胞白血病患者预后作用的meta分析研究目的评价分化簇抗原CD11b表达水平对急性髓细胞性白血病的预后作用。研究方法采用Cochrane系统评价方法,通过检索Pub Med,Embase,Cochrane Library,Web of Science和中国生物医学文献数据库(CBM)数据库,按照已制定的检索策略,进行文献筛选、质量评价、提取数据及荟萃分析,检索时间截点为2015年7月。以总生存时间(OS)、无病生存时间(DFS)和完全缓解率(CRR)作为评价指标,采用Revman5.3软件就CD11b对AML的预后作用做出较全面合理的评价。研究结果共纳入13个研究,包含2619个受试对象。Meta分析结果表明,与CD11b阴性患者相比,CD11b阳性AML患者完全缓解率CRR明显降低(OR=0.44;95%CI,0.25-0.79;p=0.006),总生存时间OS亦明显降低(HR=0.66;95%CI,0.55-0.80;p<0.0001),而两者在无病生存时间方面无明显统计学差异(HR=0.67;95%CI,0.31-1.48;p=0.32)。而围绕种族、CD11b阳性临界值、治疗方案、AML分型、样品制备方法为划分标准进行的亚组分析结果表明,这些因素对CD11b表达水平对AML预后作用均无明显影响。仅纳入NOS高评分研究的敏感性分析结果与总的Meta分析结果一致。结论CD11b表达阳性AML患者相比于CD11b阴性患者预后更差,同时本meta分析结果提示CD11b有望成为AML的新的预后指标。