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哺乳动物防御素是一类属于内源性抗菌肽家族中具有广谱性的阳离子多肽,也是许多器官的天然免疫的重要介质。根据防御素分子内半胱氨酸残基的连接方式、位置以及前体性质的差异可将其分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、植物防御素和昆虫防御素五种类型,其中β-防御素具有多种抗菌、抗真菌、抗病毒活性并且带电荷氨基酸和特殊氨基酸的改变会导致抗菌谱的变化。β-防御素主要分布于呼吸道、胃肠道、生殖道表面和腺体中,形成抵抗病原体的第一道重要防线。β-防御素的前体分子一般由64~68个氨基酸残基组成,其中包括成熟序列由38~42个氨基酸组成,信号序列和前导序列是22~32个氨基酸残基。在整个氨基酸序列中只有2种氨基酸残基(共8个氨基酸)具有高度保存性,第一种是位于N末端的甘氨酸(2个),第二种是位于中间段成熟肽中的半胱氨酸(6个)。
首先选定了纯系的宁夏滩羊作为实验动物,采集了防御素分布较多的气管、食道和口腔等部位的粘膜组织,提取组织总RNA,根据已公布的绵羊β-防御素基因序列设计引物,连接到pEASY-Blunt载体后,测序获得滩羊β-防御素基因全序列。然后将前原肽和成熟肽基因分别连接到pET-32a上构建原核表达载体pET-32a-pSBD和pET-32a-mSBD,转入大肠杆菌BL21中,通过IPTG对工程菌的诱导表达并检测两种蛋白的活性。进一步扩增前原β-防御素肽基因并双酶切该片段,亚克隆到逆转录病毒载体PLEGFP-N1的多克隆位点,构建了一个逆转录表达载体PLEGFP-N1-SBD,用磷酸钙转染法转染到包装细胞293-T中,24 h-48 h后收集逆转录病毒液。用病毒液侵染羊成纤维细胞并提取此细胞的蛋白,在蓝光激发光下能观察到绿色荧光蛋白。为了便于蛋白的纯化,选择在N端加上一个His-tag,通过镍柱分离纯化蛋白,用Western-Blot分析特异性同时采用BCA法对纯化后的蛋白进行定量。分别选取了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为受试菌株,运用药敏纸片法和二倍稀释法测定SBD蛋白在体外的抗菌效果。选取水泡性口炎病毒作为受试病毒,运用MTT法检测了重组蛋白对水泡性口炎病毒抑制作用。
应用PCR方法成功克隆了滩羊β-防御素(SBD)基因,对基因序列测序分析发现该基因序列全长299 bp,由信号肽、中间片段和成熟肽序列组成。将滩羊β-防御素序列登陆GenBank,获得了基因登陆号HM593790。将前原肽和成熟肽的基因分别克隆到pET32a(+)中,构建了原核表达载体pET-32a-pSBD和pET-32a-mSBD,实现了β-防御素的表达。对两种蛋白变性、复性后的抗菌活性显示,前原肽蛋白无活性,成熟肽蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈分别为19 mm和15 mm。成功构建了病毒表达载体PLEGFP-N1-SBD,并在羊成纤维细胞中实现了β-防御素的表达,表达量是114.4μg/mL,分子量约为40 kd。纯化后β-防御素蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用,抑菌圈大小分别为10 mm和8 mm;β-防御素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为28.6μg/mL和.57.2μg/mL。对水泡性口炎病毒具有一定的抑制作用,用同等浓度病毒作用细胞,加入重组蛋白实验组细胞的存活率显著上升,凋亡细胞明显减少。