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牛诺如病毒(Bovine Norovirus,BNoV)是一种引起犊牛腹泻的病原,并已经在意大利,韩国和中国等19个国家报道检出。BNoV属于GIII,进一步可细分为GIII.1和GIII.2两种基因亚型。2017年,本实验室证明了BNoV在我国的存在,但BNoV在国内的流行情况和基因组尚无研究,本研究的目的是调查我国BNoV的流行情况及基因组特征,取得以下成果:1首次证明BNoV在我国奶犊牛中广泛流行,并具有独特的进化特征牛诺如病毒是一种引起犊牛腹泻的病原,本研究旨在调查该病毒在国内部分地区BNoV的流行情况及分子特征。采用RT-PCR对采自国内6省的25个养殖场的265份奶犊牛粪便样本进行BNoV检测,其中有211份腹泻粪便样本和54份健康粪便样本。结果显示:腹泻样本中BNoV检出率为20.4%(43/211),显著高于健康粪便样本中9.26%的检出率(P<0.01),证明该病毒与犊牛腹泻息息相关;四川省、辽宁省、河南省、新疆维吾尔自治区和山东省的腹泻样本中BNoV检出率分别为34.8%(8/23),53.2%(25/47),11.1%(3/27),6.9%(6/87)和9.1%(1/11),陕西省的腹泻样本中未检出BNoV。5省43个奶牛BNoV RdRp基因片段的遗传进化分析显示,38个聚集在GIII.2,5个聚集在GIII.1。5省26个奶牛BNoV VP1基因片段的遗传进化分析显示,23个聚集在GIII.2,并共同聚为独立的一大枝,1个聚集在GIII.1,剩余2个聚集在独特的一大枝上;4省17个奶牛BNoV VP2基因片段的遗传进化分析显示,17个都聚在GIII.2中独立的一大支。结果表明我国奶牛BNoV VP1和VP2基因片段具有丰富的遗传多样性。本研究证明BNoV已在国内的奶牛中广泛流行,是国内犊牛腹泻的新发病原,且国内的BNoV毒株具有独特的演化趋势,为犊牛腹泻的防控提供了重要参考。2.首次证实BNoV在牦牛中存在牦牛是青藏高原的独特牛种,是青藏高原高海拔地区的标志性象征。这项研究的目的是调查中国牦牛中是否存在BNoV。在2018年5月至2018年7月期间,采集了四川省的77份牦牛腹泻粪便样本,采用RT-PCR方法进行BNoV检测。结果显示,2份牦牛腹泻粪便样本为BNoV阳性。基于RdRp片段的遗传进化分析表明,这2个RdRp序列属于GIII.2并与国内奶牛的GIII.2毒株遗传距离最近。进一步扩增获得1141bp RdRp序列,与GenBank中所有GIII RdRp序列相比具有11个相同的核苷酸突变和3个相同的氨基酸突变。这是在牦牛中首次检测到BNoV,提示应提高对牦牛源BNoV的传播和监测的意识。3.鉴定了一种新VP1基因型的BNoV,并成功获得其完整基因组鉴于前期工作中意外的鉴定了两个具有独特VP1基因的BNoV,选择其中的Bo/BET-17/18/CH毒株进行基因组扩增。结果显示,基因组长度为7321bp,与所有五个BNoV基因组的核苷酸相似性为79.4%-80.9%,聚集在遗传进化树的一个单独分支上,这表明Bo/BET-17/18/CH可以代表一种新的BNoV。其基因组具有两个重要特征:i)VP1序列与已知的所有BNoV VP1序列有很大差异,可能代表了一种新的VP1基因型;ii)在ORF1-ORF2连接处预测了重组事件。此外,16.3%(7/43)的BNoV阳性样本被鉴定为新VP1基因型,这些样本分布在两个省的四个养殖场中,表明该新的VP1基因型已经在当地省份蔓延。本研究结果对深入理解BNoV的遗传多样性和流行有重要意义。4.建立了检测BNoV的Real-time RT-PCR方法大多数关于BNoV的分子检测引物都靶向其RdRp 3’末端序列,前期克隆的BNoV RdRp序列表现出独特的进化趋势并存在较多的核苷酸突变,可能会影响国内BNoV检出率的准确性。本研究的目的是建立检测BNoV的Real-time RT-PCR方法。根据前期扩增的国内BNoV RdRp序列设计简并引物,经过优化后成功建立一种检测BNoV的Real-time RT-PCR方法。该方法最低检测下限为3.7copies/μL;该方法只特异性检出BNoV,其他常见牛腹泻病原不检出;批内和批间的变异系数均<2%。该方法对45份犊牛腹泻样本BNoV的检出率为71.1%,高于国外文献报道两种检测方法。因此,该方法具有特异性和稳定性好,灵敏度高的特点,有助于未来继续开展国内BNoV的分子检测,为科学防控BNoV提供依据。