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3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)作为大多数拟除虫菊酯类农药的分解产物之一,不仅对水体、土壤、农畜产品造成二次污染,更切断了该类农药彻底转化为无毒小分子的生物降解途径,间接地使农产品农药残留问题更加严峻化,严重威胁到人体健康和食品质量水平。生物降解以其高效、无二次污染被认为是消除异生化合物污染的重要手段。本着来之于食品而用之于食品的初衷,针对3-PBA降解菌来源单一、菌种资源种类少、降解途径阐述不全面的问题,本实验建立针对真菌3-PBA降解体系的HPLC检测方法及前处理方法,以传统发酵食品为菌株筛选源,以真菌为筛选目标菌,以期获得具有较高降解能力的菌株资源,并对其基本特性和降解途径进行初步研究和推导,并为菌株的进一步研究和应用提供理论依据。
1.真菌降解体系中3-PBA测定方法的建立
以全量取样方式,超声30 min辅助乙腈提取,采用HPLC-UV法测定真菌降解体系中3-PBA含量。以Gemini100A C18柱(5.0μm,150 mm×4.60 mm,I.d.)为色谱柱;流动相:磷酸调节水pH值为2.5,乙腈:水(55:45,V/V);流速:0.7 mL/min;柱温:25℃;用紫外检测器在210 nm处检测3-PBA。结果显示3-PBA对照品的保留时间为7.19 min,线性范围为0.5～50 mg/L,3-PBA平均回收率为97.51％,RSD为1.89％。运用该方法测得3种不同来源的混合菌株发酵液和2株实验室保藏标准菌株发酵液中3-PBA的残留量分别为63.84、10.54、20.81、63.65、33.68 mg/L。本法简单、快速、准确、分离度好,为3-PBA降解真菌的筛选及研究提供了方法参考。
2.3-PBA降解真菌的筛选、鉴定及急性毒性试验
分别从醋醅、酱油曲、酒曲中分离获得10株霉菌和来自实验室保藏的2株标准霉菌对3-PBA具有降解作用,测试菌株3 d内降解率为39.32％～80.10％,其中以来自于酱油曲的编号为M4菌株对3-PBA降解率最高可达80.10％,选择M4为后续试验的供试菌株。根据形态特征和ITS序列分析(GenBank登录号为JF461319)将M4鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae M4)。以小白鼠为攻毒对象,对M4麸皮培养物的孢子悬液进行急性毒性试验。结果表明,雌雄小白鼠经口LD50均大于15000mg/kgBW,其为实际无毒。首次从传统发酵食品中筛选获得3-PBA降解真菌,为该类物质降解菌株的筛选提供了新思路。
3.M4的降解特性及降解途径初步研究
M4以共代谢方式降解3-PBA,并且降解3-PBA的酶属组成酶,不需3-PBA诱导。初级碳源的种类(葡萄糖、蔗糖、淀粉)对3-PBA降解影响不大,葡萄糖含量对3-PBA及其代谢产物的降解均有不同程度的影响。M4对3-PBA的降解反应属一级反应,在pH=7.0,30℃下,3-PBA初始浓度为100 mg/L的PBS(50 mM)中3-PBA降解动力学方程为y=0.0507x+4.694,半衰期为13.670 h,大大缩短了3-PBA的自然降解半衰期,并且pH和温度对反应影响不大,但该反应对3-PBA浓度较为敏感。通过降解图谱比对、对照品比对和化学结构分析,推断其降解途径是:M4首先转化为3-羟基-5-苯氧基苯甲酸,再分解为没食子酸和苯酚,苯酚再生成邻苯二酚,邻苯二酚和没食子酸的下游分解代谢还需进一步探讨。米曲霉降解3-PBA途径与之前的研究有较大差异,尚属首次报道。
论文研究结果不仅可为米曲霉M4降解3-PBA的机理及途径奠定基础,而且可为消除环境和食品中该类物质残留提供有价值的参考数据,具有一定的理论意义和实际应用价值。