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甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解反应的关键酶,其编码基因一直作为管家基因存在,被广泛用作qRT-PCR和Western blot等实验操作的标准化内参。然而随着研究的深化,新的发现让越来越多的学者倾向于认为GAPDH基因是可调控的,在植物抗逆境胁迫中具有重要作用。本研究对长武134小麦细胞质TaGAPC蛋白半胱氨酸Cys154、Cys158残基进行了定点突变分析及小麦二叶一心期幼苗在逆境胁迫下的叶片GAPDH总活性进行了检测。试验结果如下:(1)以TaGAPC基因为模板,通过重叠延伸PCR法分别对该基因编码蛋白Cys154、Cys158残基进行定点突变,成功构建了pGEMT-easy-TaCys154S/TaCys158S克隆重组载体。在此基础上,进一步构建了TaGAPC及其突变体TaCys154S/TaCys158S基因的原核表达载体。对融合蛋白诱导表达条件进行优化,条件如下:诱导温度为25°C,诱导时间是12h,诱导剂IPTG浓度选择0.25mmol/L。(2)可溶性分析检测显示TaGAPC及其突变体TaCys154S/TaCys158S蛋白均是可溶性的。采用超声波破碎法和镍柱亲和层析技术分离纯化得到TaGAPC及其突变体TaCys154S/TaCys158S融合蛋白,对其进行活性分析结果显示TaGAPC蛋白活性为48.84U/mg,而突变体蛋白TaCys154S、TaCys158S均未检测到相应的活性。由此推断,Cys154、Cys158对TaGAPC蛋白活性均有重要影响,为其重要的催化活性残基。(3)分别对生长至二叶一心期的长武134小麦幼苗进行逆境胁迫处理,处理组分别为20%PEG8000干旱胁迫、不同浓度的H2O2(10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L)处理及复合胁迫(20%PEG8000+100μmol/L H2O2),并分别于处理后0h、2h、6h、12h、24h取样检测叶片GAPDH活性变化。试验结果显示20%PEG8000和100μmol/L H2O2对小麦叶片GAPDH总活性具有明显促进作用,但100μmol/L H2O2与20%PEG8000的复合胁迫则抑制了GAPDH活性的增加,这表明逆境条件下叶片GAPDH蛋白总活性与其活性半胱氨酸残基位点即突变位点相关,这为深入认识TaGAPC基因响应小麦干旱胁迫的作用机理提供一定的理论依据。