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蛋白质的翻译过程是生命最基础的过程之一,其中翻译起始过程是决定蛋白表达水平的重点。近年来研究发现mRNA上5’非翻译区(5’UTR)核苷酸序列能够显著影响蛋白翻译起始,进而调控蛋白表达水平。5’UTR序列含有重要蛋白翻译调控元件,但对5’UTR调控翻译起始机制的研究还比较贫乏。本课题拟以酿酒酵母为对象构建高通量5’UTR元件表征体系,采用随机引物合成的方法人工合成随机5’UTR元件库,通过使用以流式细胞术和测序技术为基础的高通量表征体系,确定不同5’UTR序列对蛋白表达水平的影响,计算分析起上调或下调翻译起始作用的5’UTR序列特点,从而挖掘潜在的序列元件和结构元件,以期揭示5’UTR调控蛋白翻译起始的分子机制。主要工作如下:(1)使用分子克隆的方法构建5’UTR序列表达元件:包括构建以绿色荧光蛋白为信号分子的5’UTR表达载体;构建具有红色荧光蛋白为参比的背景酵母菌株;并采用两种不同表达方式实现了酿酒酵母细胞红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP的共表达,一种方案是先将红色荧光蛋白基因整合到宿主细胞基因组中,得到具有红色荧光的宿主菌,再将绿色荧光蛋白整合到红色荧光蛋白宿主菌株中;另一种方案是将绿色荧光蛋白基因与红色荧光蛋白基因克隆到一个游离型穿梭质粒上,再将表达GFP/mCherry的质粒转化宿主细胞。分析不同表达方案下荧光蛋白的表达特点,结果表明,采用整合型酵母质粒表达mCherry和GFP,所产生的红色荧光和绿色荧光波动范围较窄、信号强度稳定,游离型酵母质粒表达GFP和mCherry,产生的荧光波动范围较宽而更适合文库的构建。(2)选取长度在50 bp左右基因表达效率存在较大差异的5个5’UTR序列,通过酶切连接到5’UTR序列表达载体YIplac211–RPL8A-GFP进行表达测试,结果发现测试5’UTR序列能够显著改变绿色荧光蛋白的表达量。(3)采用易错PCR的方法初步尝试建立“5’UTR序列-蛋白表达量”的一一对应关系,结果发现假阳性率高且突变跨度范围窄。(4)选取一个基因表达效率最高的基因YLR167W为研究对象,使用随机引物合成的方法合成5段长度为89 bp、包含12个随机碱基和酶切位点、保护碱基以及起始密码子的单链DNA。以此单链DNA为模板,PCR扩增中央随机5’UTR序列,形成5段双链5’UTR随机序列DNA文库。采用胞外连接的方法将随机序列DNA与表达载体YCplac33-RPL8A-GFP-mCherry一起转化酿酒酵母宿主菌株W303-1b中。使用流式细胞分选(FACS)技术对表达随机5’UTR序列质粒文库的菌株进行筛选,按照绿色荧光蛋白荧光信号的强弱将细胞分成10个不同的档次,分别收集不同档次的细胞(不少于80万个细胞/收集管)。FACS分析收集不同档次的细胞结果显示,蛋白表达强弱差异在40倍左右。对不同档次的细胞进行简单测序,测定被表达5’UTR序列。建立“5’UTR序列-蛋白表达量”的一一对应关系。