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研究背景血小板是一种直径2～5μm且呈圆盘状的无核小细胞,在血小板细胞浆中发现大量的细胞器和具有分泌功能的颗粒。血小板是机体循环血液中的重要组成部分,其功能作用主要体现在维持出血和止血的动态平衡,并且参与组织修复、炎症反应和肿瘤生长等病理生理过程。巨核细胞是由骨髓中造血干细胞分化形成的,主要负责产生血小板,它是人体骨髓中唯一的多倍体细胞,占骨髓有核细胞总数的0.05%。巨核细胞分为:颗粒型巨核细胞、产生血小板型巨核细胞和裸核型巨核细胞。在经历增殖、分化成熟和多倍体化后,每个巨核细胞可产生1000～6000个血小板。再生障碍性贫血、骨髓占位性疾病、病毒感染、药物、有机化学试剂及辐射等均可导致骨髓巨核细胞生成和分化水平的下降,最终引起血小板减少症的发生。近年来研究表明,巨核细胞分化和前血小板形成的功能障碍均可导致严重的血小板相关疾病。然而,调控巨核细胞成熟分化和血小板生成的作用机制仍需要深入探索。E1A激活基因阻遏子基因（cellular repressor of E1A-stimulated genes1,CREG1）是一种分泌型的糖蛋白,具有维持组织和细胞成熟分化的重要生理功能。CREG1蛋白由220个氨基酸构成,含有3个M6P（mannose-6-phosphate）糖基化位点,能与M6P受体相互作用。研究发现CREG1在分化成熟的组织,如心脏、脾脏、肝脏及血管等组织中高表达,但在未分化组织和细胞,如畸胎瘤细胞中表达极低。Veal研究团队用CREG1蛋白刺激体外培养的畸胎瘤细胞,发现CREG1蛋白能够抑制细胞增殖并促进畸胎瘤向神经细胞的自发性分化。这些结果提示CREG1可能是重要的促进细胞分化的内稳态调控因子。本课题组前期研究发现CREG1能够维持血管稳态平衡、促进内皮修复及抑制高血压引起的主动脉血管纤维化。在肝细胞Creg1基因特异性敲除小鼠模型中,肝细胞Creg1的缺失可导致小鼠发生肥胖和糖脂相关代谢紊乱。此外,外源性重组CREG1蛋白通过调控自噬通路改善小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心功能。因此,CREG1在心血管内稳态调控中发挥重要作用,为防治心血管重构提供了新线索新思路。近期我们发现,在单核巨噬细胞特异性敲除Creg1基因的小鼠模型中单核巨噬细胞出现分化异常和功能障碍;且CREG1在人和小鼠的血小板和巨核细胞中大量表达,血小板减少症患者的血小板中CREG1表达下降,但CREG1是否具有促进巨核细胞成熟分化及血小板生成的作用尚不清楚。我们的研究目的是阐明CREG1在巨核细胞分化和血小板生成中的作用及分子机制。研究发现血小板减少症患者的血小板中CREG1表达下降;进一步应用阿糖胞苷（cytosine arabinoside,Ara-c）诱导小鼠建立血小板减少症模型,发现巨核细胞和血小板中CREG1表达的减少与血小板减少症存在相关性。从巨核细胞分化和血小板生成为切入点,利用巨核细胞/血小板特异性Creg1基因敲除小鼠(Creg1-/-)和Creg1转基因小鼠（tg-Creg1）作为研究模型,发现Creg1-/-小鼠血小板数目降低,巨核细胞分化障碍。在phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）刺激诱导Dami细胞（巨核细胞系）分化的模型中CREG1通过调控细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2）信号通路促进巨核细胞分化和多倍体化。为深入阐明CREG1调控巨核细胞分化的分子机制,我们确定了h CREG1基因的核心启动子,应用双荧光素酶报告基因实验（dual-lusiferase report assay,Lusiferase）发现转录因子C/EBPβ（CCAAT enhancer binding protein beta）与h CREG1的核心启动子区相结合,并显著上调了h CREG1核心启动子的活性,促进了巨核细胞成熟分化。本研究阐明了CREG1调控巨核细胞分化和血小板生成的作用及机制,为血小板减少症的预防和治疗提供了坚实的理论基础。研究方法（1）血小板减少症模型的建立:腹腔注射Ara-c 200 mg/kg/day 2天,50 mg/kg/day 3天,分别在第5天和第10天时检测血细胞的数目。第10天时血小板数目仍然降低,而白细胞和红细胞数目基本恢复正常,应用此剂量的Ara-c建立的血小板减少症模型比较稳定。（2）构建Creg1-/-和tg-Creg1小鼠:利用Cas9/RNA system gene targeting技术,构建巨核细胞/血小板Creg1-/-小鼠模型。利用原核注射的方法制备tg-Creg1小鼠模型。（3）小鼠血小板寿命的检测:利用鼠尾静脉注射的方法将Dy Light 488荧光标记的rabbit-anti-GPIX（CD42a）抗体注射到小鼠体内,分别在注射前和注射后不用时间点取血,应用流式细胞学的方法检测不同组别小鼠的血小板寿命情况,观察血小板的清除速率。（4）小鼠血小板生成的检测:利用鼠尾静脉注射的方法将rabbit-anti-GPIbα（CD42b）抗体注射到小鼠体内,分别在注射前和注射后不同时间点检测血小板的数目,观察血小板的生成曲线。（5）TPO干预治疗:利用鼠尾静脉注射的方法将重组TPO注射到小鼠体内,分别在注射前和注射后第4天检测血小板的数目。（6）骨髓巨核细胞的诱导和分离:提取骨髓中的细胞后使用含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞,加入重组人干细胞因子（recombinant stem cell factor,SCF）和重组TPO,应用BSA梯度离心法可获得巨核细胞。（7）胎肝巨核细胞的诱导和分离:选取胎龄为13.5～15天的孕鼠,取出胎肝,磨碎,过滤等操作步骤后,在5%CO2,37℃的孵箱中培养4～5天,每日加一次同等剂量的重组TPO。应用BSA梯度离心法可获得巨核细胞。（8）前血小板的生成检测:使用纤维蛋白原（fibrinogen,Fg）包被无菌的玻璃片,将胎肝诱导分离的巨核细胞种植在玻璃片上,在含5%CO2,37℃的孵箱中培养。显微镜下观察巨核细胞形态的变化。利用免疫荧光染色的方法鉴定前血小板的形成。（9）Lusiferase活性检测:构建h CREG1核心启动子片段（包括突变的片段）表达载体和转录因子质粒,利用Lusiferase实验技术方法检测转录因子对h CREG1核心启动子活性的调控作用。实验结果（1）CREG1的缺失导致血小板数目的减少,即血小板减少症的发生。（2）CREG1的缺失导致血小板生成减少,而不是外周血中血小板被清除增多。（3）CREG1的缺失引起髓外造血,脾脏肿大。（4）CREG1的缺失抑制巨核细胞多倍体化、DMS成熟和前血小板的生成。（5）CREG1调控ERK1/2信号通路促进巨核细胞分化和多倍体化。（6）转录因子C/EBPβ调控h CREG1核心启动子的活性。结论总结本课题,CREG1可能作为一种新的调控因子参与了巨核细胞的分化和血小板的生成。C/EBPβ作为转录因子与h CREG1核心启动子相结合,通过影响h CREG1核心启动子的活性进一步激活ERK1/2信号通路,促进巨核细胞分化和血小板生成。CREG1作为整个环节中的关键靶点,为血小板减少症的预防和治疗提供了理论基础和新的研究方向。