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目的: RYBP是PcG蛋白依赖的转录抑制因子,通过一系列表观遗传学机制参与细胞的增殖与分化和肿瘤的发生发展等多种生理和病理过程.我们前期研究发现RYBP在白血病细胞中高表达并介导白血病细胞凋亡,可以增加化疗敏感性,但其介导细胞凋亡的机制尚未清楚.本研究将通过高通量测序技术进一步探讨RYBP介导白血病细胞凋亡的靶基因,为后续研究其表观遗传学调控机制打下基础. 方法: 1.复苏及培养HL60细胞、293T细胞. 2.利用LV008慢病毒干扰载体构建慢病毒shRNA质粒. 3.293T细胞包装LV-shRYBP慢病毒,感染白血病细胞株HL-60,在嘌呤霉素抗性筛选后,通过观察绿色荧光蛋白的表达评估转染率,QPRC技术检测沉默效果,建立稳定低表达RYBP基因的HL60稳定细胞株及空白对照细胞组. 4.利用高通量测序技术对上述两组、各3对细胞进行转录组水平测序及miRNA测序,对靶基因进行GO富集和KEGG Pathway分析,通过对靶基因的筛选,预测RYBP介导白血病细胞凋亡的靶基因. 结果: 1.HL60细胞沉默株(HL60-siRNA)及空载对照组(HL-60-NC)荧光显微镜下拍照观察GFP阳性率>95%,收样本QPCR验证干扰效果显示:HL60-siRNA RYBP mRNA表达量为(0.28±0.006),HL-60-NC RYBP mRNA表达量为:(0.94±0.067),HL60-siRNA组RYBP基因表达水平明显低于HL-60-NC组(P<0.05). 2.RNA-seq高通量测序共检测到上调基因113个,下调基因439个(P<0.05),差异基因的GO注释及功能显著性富集分析得出SiRYBP-VS-NC(SIRYBP为RYBP沉默实验组,NC为空白对照组)上调表达主要富集出发育过程中的细胞成熟、蛋白异源二聚化、核小体组装等方面的功能.SiRYBP-VS-NC.下调表达主要富集出NK细胞结合、生物碱代谢等功能(corrected p-value≤0.05). 3.通过RNA-seq高通量测序分析差异基因的Pathway显著性富集分析得出:SiRYBP-VS-NC.上调仅富集出系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)、酗酒(Alcoholism)相关的通路.SiRYBP-VS-NC下调主要富集出氨基酸合成,癌症转录调节紊乱,氨基酸代谢,阿米巴病等相关的KEGG pathway; 4.miRNA高通量测序分析得出:SiRYBP-VS-NC共检测到上调基因32个,下调表达基因26个.(SiRYBP是实验处理样品,比较的结果分为上调基因和下调基因.SiRYBP-VS-NC上调是指基因在SiRYBP系列样品中相对于在NC系列样品中表达显著上升). 5.miRNA与mRNA共表达分析表明:沉默RYBP后,对样本中不同表达的miRNA(58个)与mRNA(552个)在miRNA和mRNA的相关系数≧0.99时,共有68个mRNA与14个miRNA存在显著的共表达关系.我们发现RYBP沉默后,SPI1与hsa-miR-214-3p显著性下调(FDR<0.05). 6.差异表达的m iRNA靶基因预测:miRNA通过与靶基因上的特定区域互补配对,结合特定的蛋白从而对靶基因的转录或者翻译过程进行调节.分别用TargetScan和miRanda两种软件做miRNA靶基因预测,将两种软件预测的共有结果作为靶基因预测结果,共有97912个. 结论： 1.利用慢病毒介导的RNA干扰技术,成功构建RYBP基因稳定低表达的HL-60细胞株. 2.RYBP高表达可诱导白血病细胞凋亡而发挥抗肿瘤效应. 3.RYBP沉默后,SPI1和与-miR-214-3p显著性下调(FDR<0.05).RYBP可能通过调控hsa-miR-214-3p表达水平在白血病的发生、发展中起作用. 4.在白血病细胞中,RYBP基因下调可引起BBC3、BAI1、SESN2、CCNG2、JAK3、STAT4、CTF1、IL20RB、PLAU、SPI1、BCL6、ITGAM、hsa-miR-214-3p低表达,进而可能改变磷酸化及泛素化水平,激活Jak-STAT,PI3K/Akt及RAS/Raf/MAPK这些经典信号通道及P53信号通路促进细胞凋亡. 我们后续将在白血病患者中通过PCR技术进行靶基因的进一步验证,并结合差异miRNA测序结果,利用ChIP等技术进一步阐述RYBP与这些候选靶基因的关系及其表观遗传学机制,此研究将对白血病诊断、预后、治疗发挥指导作用.