研究背景目前,心血管疾病已经成为导致世界人口死亡的主要原因,动脉粥样硬化(AS)是其主要的病理基础。在AS复杂的形成机制中,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的内皮细胞损伤是最为重要的起始环节。大量实验研究显示,大蒜和硒均具有抗氧化、抗凝血、降血脂等作用,能够抑制多种AS形成的危险因素,从而降低心血管疾病的发病风险。上世纪90年代开始,人们就考虑将大蒜与硒结合使用,以增强其抗AS的作用。本课题组早在1996年就已发现大蒜制品与无机硒联合使用能够降低高脂饮食造成的家兔血脂水平,并能降低人类的胃癌死亡率。但研究中也发现,简单地将大蒜制品与无机硒混合使用,会因其pH值不同而彼此间发生中和反应,降低各自的生物活性。另外,无机硒具有蓄积毒性因而不宜长期使用,而有机硒虽然毒性低但制备困难且价格昂贵,也难以长期使用。这些问题都使得如何能将硒与大蒜有效地结合,且既能避免硒的毒性作用,又简便、经济成为了一大难题。此时,富硒大蒜的培育成功为解决这一问题提供了新的思路。大蒜本身具有硒富集作用,若在种植时施加高浓度的硒肥,就可以从外界吸收无机硒,并通过天然的生物转化作用将其转化为有机形式。富硒大蒜不仅兼具硒和大蒜二者的生物活性成分,而且它所含有的硒成分毒性和蓄积性也大大降低。因此,若能证实富硒大蒜具有抗AS作用,则既能为防治心血管疾病提供新的方法,同时也能为富硒大蒜种植打开更为广阔的市场。目前,有关富硒大蒜抗AS作用的研究尚不多见。故此,本研究首先将对富硒大蒜的主要组成部分——大蒜和硒的抗AS作用进行探讨。由于AS是一种病理改变过程,临床上不易检出和确定。而冠心病作为AS最常导致的心血管疾病之一,在习惯上常被等同于冠状动脉粥样硬化性心脏病。故此,本研究采用冠心病代替AS作为研究对象,利用Meta分析方法对硒和大蒜防治冠心病的作用进行定量综合,以期评价二者对AS形成与发展的作用,进而从一定程度上为探讨富硒大蒜抗AS的作用提供理论基础。现有的针对富硒大蒜的实验室研究主要集中于其抗癌和抗氧化作用方面,有关其对内皮细胞作用的研究较少。而ox-LDL造成的内皮细胞损伤正是AS的重要起始环节。若能证实富硒大蒜具有抑制ox-LDL造成的内皮细胞损伤的作用,或许就可以从形成机制的角度提示其具有抗AS的作用。因此,本研究也将采用体外细胞实验的方法,探讨富硒大蒜对ox-LDL造成内皮细胞损伤中的两个主要特征——细胞活性下降和细胞凋亡的影响研究目的1.收集有关含硒或大蒜制品防治冠心病的随机对照试验文献进行Meta分析,探讨使用含硒或大蒜制品能否有效防治冠心病,以期评价二者抑制AS形成与发展的作用,进而从一定程度上为富硒大蒜抗AS作用提供理论基础。2.采用体外细胞实验的方法,探讨富硒大蒜对ox-LDL的抑制内皮细胞活性和促细胞凋亡作用的影响,同时比较富硒大蒜、普通大蒜与有机硒的单独或联合使用等四种处理措施在相同条件下的作用,为今后防治AS的研究提供依据。研究内容和方法一、含硒或大蒜制品治疗冠心病效果的Meta分析从中国期刊全文数据库(CNKI)、PubMed等七种中英文数据库中,检索出2012年1月1日前公开发表的,以使用含硒或大蒜制品防治冠心病为研究内容的中英文随机对照试验文献。对检索到的文献进行纳入、排除和质量评价,从符合入选标准的文献中提取相关数据资料,经异质性检验后进行定量合并,必要时进行亚组分析和敏感性分析,以Egger’s检验评价发表偏倚。全部统计分析采用STATA11.2软件进行。二、富硒大蒜抗ox-LDL对内皮细胞损伤作用的实验研究采用有机溶剂萃取法提取富硒大蒜油和普通大蒜油。氢化物发生原子荧光法测定富硒大蒜油中的硒含量。甲基四唑盐(MTT)比色法检测富硒大蒜油在不同浓度、不同作用时间下对人脐静脉内皮细胞株ECV-304细胞活性率的影响。采用4×3×3析因设计,检测富硒大蒜油、普通大蒜油、有机硒、普通大蒜油和有机硒联用四种处理措施在24、48、72小时三种作用时间,低、中、高三种浓度下对ox-LDL造成的ECV-304细胞活性下降的影响。流式细胞术检测富硒大蒜油、普通大蒜油、有机硒单独或联合使用等四种处理措施对ox-LDL诱导的细胞凋亡的影响。研究结果一、含硒或大蒜制品防治冠心病效果的Meta分析1.含硒制品防治冠心病效果的Meta分析1.1异质性检验及定量合并结果：共8篇文献纳入研究,异质性检验结果I2=40.9%,合并RR=0.87(0.74,1.02)。1.2亚组分析结果：按研究设计类型为临床试验或现场试验进行亚组分析,合并RR值及其95%可信区间分别为0.61(0.45,0.83)和0.99(0.82,1.20)。1.3敏感性分析结果：剔除4篇质量较低的文献后,异质性检验结果I2=0.0%,RR--0.97(0.81,1.16),与剔除前的结果相比较变化不大。1.4发表偏倚检测：漏斗图上可见各研究分布不对称,Egger’s检验的P值为0.004,提示存在发表偏倚。2.大蒜制品防治冠心病效果的Meta分析2.1异质性检验及定量合并结果：共7篇文献纳入研究,异质性检验结果I2=13.9%,合并RR=0.75(0.51,1.10)。2.2敏感性分析：剔除1篇现场试验文献后,异质性检验结果I2=0.0%, RR=0.64(0.42,0.99),与剔除前的结果相比较,变化较大。2.3发表偏倚检测：从绘制的漏斗图上可见各研究分布对称,Egger’s检验的P值为0.936,提示不存在发表偏倚。二、富硒大蒜抗ox-LDL对内皮细胞损伤作用的实验研究1.大蒜油中硒含量的检测：富硒大蒜油中硒含量为198mg/kg。2.富硒大蒜油对ECV-304细胞活性率的影响：作用24和48小时、浓度低于160μl/L时,内皮细胞活性率均高于100%；在浓度达到320μl/L或作用时间为72小时时,细胞活性率均低于100%。3.富硒大蒜油抗ox-LDL的造成细胞活性率下降的影响：富硒大蒜油各浓度组在各种作用时间条件下的细胞活性率均高于ox-LDL组(P<0.05)。尽管差异未必均有统计学意义,但富硒大蒜油组在各种条件下的细胞活性率均呈现出高于普通大蒜、普通大蒜和有机硒联用的趋势。在15μl/L、作用时间为24小时时,有机硒组的细胞活性率低于富硒大蒜油(P=0.003),而在浓度为60μl/L时,富硒大蒜油的细胞活性率低于有机硒(P<0.05)。4.流式细胞术检测细胞凋亡率结果：富硒大蒜油单独作用下的细胞凋亡率与空白对照组相比较,无统计学差异(P>0.05),但明显低于ox-LDL组(P<0.05)。富硒大蒜油与ox-LDL共同作用下的细胞凋亡率明显低于ox-LDL组(P<0.01),但与空白对照组和其他处理组间均无差异(P>0.05)。结论1.含硒制品和大蒜制品均具有缓解冠心病患者临床症状的作用。2.富硒大蒜在作用时间短、浓度低时,能促进内皮细胞活性增加。当作用时间长或浓度高时,则会抑制内皮细胞活性。3.富硒大蒜能够对抗ox-LDL的抑制内皮细胞活性作用和促细胞凋亡作用。富硒大蒜或许可以通过这一机制,起到抗AS的作用。4.在短时间、低浓度的作用条件下,富硒大蒜对抗ox-LDL的抑制细胞活性作用的效果具有优于普通大蒜、普通大蒜和有机硒联合使用的趋势,仅在浓度较高时较有机硒差。富硒大蒜对抗ox-LDL的促细胞凋亡作用的效果与普通大蒜、有机硒的单独或联合使用相似。