论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是一种呈世界性分布的，危害严重的传染病，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要原因。但其具体致病的机制尚未完全明确。HBV基因组为全长仅为3.2kb的部分双链环状DNA，含四个部分重叠的开放读码框（Open reading frame, ORF）：P，S，C，X；其中HBx蛋白是由X读码框编码的，含有154个氨基酸，分子量为16.5kD，是一个多功能蛋白，在HBV感染过程中发挥着重要的作用，是HBV重要的致病因子之一。本研究在先前CytoTrap酵母双杂交初步筛选结果的基础上，验证了HBx蛋白可与血浆铜蓝蛋白（Ceruloplasmin,Cp）在酵母中发生相互作用，并进一步确定了二者在体内和体外均可发生相互作用，最后探讨二者相互作用后HBx对Cp的功能影响，更有助于深入了解HBV的致病机制。本研究第一部分在CytoTrap酵母双杂交初步筛选的基础上，抽提出一个推定阳性克隆的猎物文库质粒，经酶切鉴定后送测序分析，鉴定为血浆铜蓝蛋白（serumceruloplasmin），并将诱饵质粒和抽提出的猎物文库质粒重新共转化到酵母中，利用CytoTrap酵母双杂交系统初步验证了HBx与Cp可在酵母中发生相互作用。本研究第二部分通过GST pull-down和免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）两个实验分别进一步证实了HBx蛋白与Cp可以在细胞外和细胞内存在相互作用，并且利用CytoTrap酵母双杂交系统确定了与Cp的发生相互作用是HBx蛋白的第51-80氨基酸区段。本研究的第三部分旨在探讨二者相互作用后，HBx对Cp及其相关功能的影响。利用Cp和HBx共转染肝癌细胞HepG2，通过检测细胞内源性活性氧（ROS），氧自由基等氧化应激指标，发现HBx可通过与Cp的相互作用抑制其抗氧化功能，间接参与了HBV的致病过程，提示Cp可能可作为抗HBV治疗的一个新的研究方向。