存在于水体中的含氮物质,已经成为很多年里,造成水体污染的主要原因之一。水体中的氮主要以氨氮,亚硝酸盐和硝酸盐的形式存在。他们主要是由于工业、农业和市政污水缺少足够的处理,直接排放而进入到水体中,造成了非常严重的环境和健康问题。涉及到含氮物质污染的水体主要表现为水中溶解氧好尽,水体毒性增强以及水体的富营养化。为了降低含氮物质对环境的负面影响,找到有效的处理方法是至关重要的。传统的处理方法是在排放到接受水体前,通过活性污泥来降低水中氮的含量。活性污泥法是用在自然界的微生物来降解水中含碳,含氮及含磷的化合物。这些微生物在自然界中,不论是在高或者是低的营养环境里,通过硝化和反硝化来完成降解过程。Nitrification and Denitrification硝化和反硝化硝化和反硝化是发生在活细菌细胞中的两个化学反应,是氮循环中的重要组成部分。生物脱氮其实是硝化和反硝化两个步骤。在第一个步骤（硝化）,氨氮在有氧的条件下转化成硝态氮,在第2步（反硝化）中,生成的硝氮在缺氧的环境里,被进一步转化为一氧化二氮或氮气。传统意义上,硝化也被认为是两步生化反应过程,两步反应方程如下所示。而这两步反应需要截然不同的两组细菌的催化才能完成。首先,在氨氧化菌（AOB）的作用下,氨氮首先被氧化成亚硝酸氮,然后再在亚硝酸氧化菌（NOB）的作用下,亚硝酸根最终被氧化成硝酸根。NH₄+ + 3O→NO₂^- + H₂O + 2H⁺ NO₂^- + O→NO₃^-反硝化是指亚硝酸根或硝酸根转化成氮气或者氮的氧化物的过程。由生物活动实现这个过程的称为生物反硝化,而通过化学减少亚硝酸根或者其他不稳定的氮的化合物则称为化学反硝化。整个反硝化过程是一个循序渐进的过程。NO₃^-→NO₂^-→X→N₂O→N₂其中的X可能是指NO。Heterotrophic Nitrification异养细菌硝化Bock和Wagner （2003） [15]对异养硝化的定义是在好氧的条件下,氨氮、羟胺或者其它含氨的有机化合物,通过各种类型的化学生物有机体,氧化成亚硝酸盐和硝酸盐的过程。在异养反硝化中,生物生长完全依懒于有机质的氧化。除了细菌,其它的微生物也能发生异养反硝化,特别是曲霉菌、青霉菌和放线菌。不同于由自养细菌所发生的反应,异养硝化是一个典型的发生在一个过程中的两级反应,且每级反应中需要的细菌种类也不同。和自养硝化菌相比,大多的异氧硝化菌只有在生长活性期后,才开始作用于亚硝酸根和硝酸根。然而,很多异养硝化菌是有能够氧化氮化合物的能力的。事实上,它们不仅能氧化氨氮、羟胺和亚硝酸根,也能氧化许多有机氮化物。已证实的异养硝化产物包括了:亚硝酸根、硝酸根、氧肟酸、肟、亚硝基和硝基化合物。通常,异养硝化的最终产物是硝酸盐,但是一些异养硝化菌也同时具有反硝化的能力。因此,这一类的细菌能同时把硝酸根还原成氮气或者是其它一些挥发性的氮的化合物。最近的相关研究主要集中在一些能在有机质上,发生生物反硝化作用的异养硝化细菌,因为,这一类型的细菌能够通过形成氮气或者其它含氮气体,来完成整个去除水中溶解氮的过程。Aerobic Denitrification好氧反硝化好氧反硝化是一个在半好氧或者全好氧的条件下,还原硝酸盐,生成一氧化氮、氧化亚氮和氮气的过程。在很多年里,由于能提供厌氧能量,反硝化一直被认为是一个厌氧过程。在反硝化过程中,第一步:硝酸先被两种酶（膜结合硝酸盐还原酶和细胞周质硝酸盐还原酶）活化,其中膜结合硝酸盐还原酶在好氧条件下作用明显,而细胞周质硝酸盐还原酶主要作用在缺氧的环境中。和有氧呼吸一样,在反硝化过程中,有机物可以完全转化成二氧化碳,而如下所列的异养细菌要么能实现完全的反硝化过程要么能实现部分的反硝化:Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Chromobacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Hypomicrobium, Moraxella, Neisseria, Paracoccus, Propionibacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Spirillium和Vibrio。但是大部分的这些细菌在市政污水中含量很低。Research Background （研究背景）为了调查控制同步硝化和反硝化的条件和反应过程,我们实验室曾进行过一个膜生物反应器的研究。在这项研究里,连续实验是通过控制反应条件和配置的废水所展开的,实验证实整个系统脱氮能力可达80%,并在系统中分离出三种细菌。在对分离出来的细菌中,进一步的实验则证实了它们异氧硝化和好氧反硝化的作用。接下来则要对于单独细菌的特性及最佳反应条件进行研究。Purpose of the Research （研究的目的）这项研究的目的是为了进一步观察从膜生物反应器中所分离出YL菌和NR菌的特性和异养去除氨氮的能力;影响两种细菌除氨氮的能力的因素,包括:碳氮比,溶解氧浓度等;分析脱氮过程中的中间产物和为两种细菌推断出合理的脱氮途径。Results （研究结果）展开此项研究的目的,是为了更好的理解两株从膜生物反应器中分离出的异养细菌:YL和NR的脱氮能力以及它们的一些特性。通过扫描电子显微镜检查发现,两种细菌的细胞都呈短杆状。根据16S rRNA序列分析,YL和NR分别被认定为属于Providencia rettgeri和Alcaligenes faecalis。下文中,这两株细菌被称为Providencia rettgeri YL和Alcaligenes faecalis NR。实验通过利用有机碳作为氨氧化的能源,来检测并比较两种细菌脱氨氮的能力。实验检测了氨在细菌新陈代谢中发生的所有变化,包括了氨浓度的变化,总有机碳浓度的变化和总氮的变化。不仅如此,实验还验证了脱氮过程中的中间产物,如羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐以及反硝化产物—氮气的产生。为了找到两种细菌最佳的脱氨氮反应条件,实验还分析了影响氨氮去除率的因素,其中包括碳氮比的影响,摇床转速的影响以及不同氨浓度的影响。最后,为了理解并找到一条合理的氨代谢途径,实验又对含有中间产物（如羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐）的特定培养基进行了考察。Tests on Ammonium Removal Ability in Providencia rettgeri YL and Alcaligenes faecalis NR两株细菌的脱氮能力在研究Providencia rettgeri YL菌除氨氮能力时,分别用葡萄糖和氯化氨作为有机碳源和氮源。在经过约4小时的滞后期后,细菌开始增长。伴随着细菌的增长,氨氮浓度也随之降低,在经过仅仅12小时培养后,氨氮浓度降低了99.9%,去除速率达到6.9mg/L.h。24小时后,由于氨氮反应完全,细菌停止增长。整个周期中,总有机碳和总氮浓度都有所下降,两者分别下降了75%和77.2%。这些数据都证明了Providencia rettgeri YL菌的脱氮能力。对于氨的新陈代谢过程,实验还检测出了硝化产物:羟胺、亚硝酸根和硝酸根,并通过用300 mg/L的氨盐充氧密封血清瓶的气相色谱,检测到了氮气的生成。这里,氨发生的所有变化可以看成一个简单的脱氨氮的过程,而在整个实验过程中,碳氮比保持在10,温度恒温在30°C,摇床速度控制在每分钟120转。在考察Alcaligenes faecalis NR的脱氮能力时,除了改用柠檬酸三钠作为碳源,其它反应条件如碳氮比、温度和摇床转速均与Providencia rettgeri YL相同。实验发现,24小时培养后,氨被NR完全消耗,去除速率达到2.3mg/L.h。此外,对于生长一开始的滞后期,NR明显要比YL来的长,这说明了NR需要相对较长的驯化期。同时,细菌的生长速度被认为是一个可能影响氨氮去除速率的因素,而实验发现这一因素影响NR的程度要比YL来得小。对于整个过程中总有机碳和总氮的变化,相对反应初始,总有机碳降低了83%,总氮降低了82.4%。同样地,这些数据也清楚地证明了Alcaligenes faecalis NR的脱氨氮能力。与Providencia rettgeri YL相比,Alcaligenes faecalis NR脱氮的中间产物:亚硝酸根和硝酸根浓度明显要高,而氮气只有在初始氨浓度很高的时候才能被测出。尽管这样,这也可以证明了好氧反硝化过程的发生。（A）所有的实验结果都表明了,两株细菌不但都具有脱氮的能力,而且能在好氧的环境下,实现了反硝化过程。与传统的厌氧反硝化不同,这个过程在好氧的条件下进行,因此,可以被认为是一种通过异养细菌实现的新型脱氮工艺。根据我们的发现,我们把异养细菌脱氮定义成:“一类细菌,在好氧的环境下,以有机碳作为能源直接把氨氮转化成氮气的能力。”Factors Affecting Ammonium Removal Ability影响脱氨氮能力的因素在保证120 mg/L氨浓度的前提下,改变碳浓度来调节培养基里的碳氮比。实验发现两株细菌对碳氮比变化的影响程度基本相同。在研究两株细菌增长的实验中,两株细菌的生长并没有因碳氮比的变化而发生明显的变化。在碳氮比为10,20,30时,两株细菌的吸光度变化非常的相似,都是先变大,随着氮源的减少而降低（尽管培养基中还有剩余的有机碳源）。然而,当碳氮比为5时,细菌的吸光度有略微的变小,这主要是跟培养基中碳源不足有关。在不同碳氮比的条件下,尽管吸光度值有所不同,细菌的生长过程基本相似。因此,认为在有机碳足够的情况下,有机碳浓度对细菌的新陈代谢只有轻微的影响作用。相反的,当有机碳不足时,有机碳浓度对生物生长有明显的作用。在碳氮比为5时,氨氮很快的被消耗完（YL: 10-15个小时,NR: 24小时）。而当碳氮比为10、20和30时,只有在培养结束时,氨氮才完全反应。对于培养基中相对应的总有机碳的变化,在碳氮比为5时,碳很快的被消耗（YL在培养12小时后,剩余20%的有机碳,而NR在培养24后,有机碳剩余14%）。之后,由于培养基里剩余有机碳过少,很难维持细菌的生长。在碳氮比为10时,碳氮基本完全反应,而增大到20和30时,即使氨氮消耗完之后,还有过多的有机碳剩余。这些实验证实了尽管两株细菌都有脱氮的能力,但是过低的有机碳浓度降低了去除氨氮的效率;而在过多的有机碳源的条件下,尽管脱氨速度与有机碳浓度无关,但是会有剩余的有机碳没有反应完全。因此,最适合的碳氮比发生在当碳比氮为10时。对于检测摇床转速对两种细菌脱氨氮能力影响的实验,反应时间均采用48小时,反应温度为30°C。实验发现,转速为120转/分钟时,两株细菌的去除率都达到了99%以上。当转速降低到80转/分钟时,细菌YL的去除率为51%,60转/分钟则为33%。而细菌NR在80转/分钟和60转/分钟的去除率则分别仅有40%和21.3%。低转速代表了反应时的溶解氧较少,反之则溶解氧较多。这一去除率跟转速,即溶解氧浓度成正比的现象,更好得解释了YL和NR都是在好氧的环境条件下进行脱氮。变初始氨浓度,并控制在YL和NR都能处理的范围内,即氨氮控制在20-300mg/L。这样,细菌的脱氨氮能力就不会因为浓度的差别过大而受到影响。然而,随着氨氮的浓度升高,毫无疑问,完成整个脱氮过程所需的时间就越长。300mg/L的氨氮,YL需要24-36小时的培养,NR则需要36-48个小时。实验中,总氮的变化也有同样的现象。尽管YL和NR可以处理不同浓度的总氮,但是当浓度较高时,处理率则有所降低。高氨氮浓度,YL的平均处理率为80%,NR的为72.3%,相对于低浓度的92%和80%。Study on the Production and Removal ability of Intermediate Products Hydroxylamine, Nitrite and Nitrate by Providencia rettgeri YL and Alcaligenes faecalis NR去除中间产物能力的研究这项实验中氮源改成脱氨氮过程的中间产物:羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐,这是为了证实YL和NR在整个新陈代谢中,同时具有转化脱氮中间产物的能力。由于有机碳作为整个过程的能量来源已经确认,这就说明了两株细菌都有异养硝化的作用。而此后的是实验主要是对去除羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐能力的研究。实验中,三种物质的浓度都采用10 mg/L作为氮源。实验发现,表征细菌增长的吸光度在三种物质的培养基中都没有明显的变化,这就说明这三种物质都不适合作为两株细菌生长的氮源。可是,同时实验也发现,随着羟胺的浓度的降低,可以检出亚硝酸根和硝酸根,且浓度也有一定程度的下降。通过一系列的去除实验可以总结出:细菌可以氧化羟胺,生成亚硝酸盐,并进一步氧化成硝酸盐;而作用在亚硝酸盐的实验证实了,细菌可以直接氧化亚硝酸盐生成硝酸盐;最后,作用在硝酸盐的实验中,培养基中的硝酸氮没有明显变化,且羟胺和亚硝酸根浓度也没有上升。根据Richardson D J et al.（1998）研究的生物异养硝化脱氮途径,Providencia rettgeri YL和Alcaligenes faecalis NR合理的脱氮途径可用下式表示。这说明了最近提出的异养细菌通过硝化和好氧反硝化实现脱氮的过程是符合传统生物脱氮的途径。然而今后的研究还需要通过对¹⁵N的追踪和酶分析来进一步的证实脱氮途径。