恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putidaKT2440)是模式环境微生物菌株,也是异源表达的良好宿主菌。高效率的电转化方法对于基因的引入及后续实验非常关键。本研究通过条件优化,建立了高效的电转化方法。EM培养基培养菌体至OD600=0.6～0.75,冰冷的3 mmol/L,4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,pH=7.0)的缓冲液洗涤菌体三次,菌体浓缩300倍,50μL分装并用于一次电转化。电转化条件:1.2kV,200Ω,25μF。1 mL SOC培养基悬浮后,转至15 mL聚丙烯离心管培养2 h,转化效率可高达3.0×108转化子/μg,比目前为止文献报道的该菌株电转化效率高出30倍左右。实验结果还表明,转化DNA浓度与转化子数目呈线性关系。　　 建立道诺菌素、阿霉素和表阿霉素的高效液相色谱分析方法:色谱柱为Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温为30℃,流速为1.0 mL/min,流动相为十二烷基硫酸钠溶液-乙腈-甲醇(500:500:60,用磷酸调 pH2.2),检测波长为254 nm;结果:道诺霉素保留时间19.7 min,阿霉素保留时间10.9min,表阿霉素保留时间12.4 min,三种化合物进样量在0.1μg～2μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系;本方法灵敏度高、准确,可以对阿霉素类化合物进行定性定量分析。　　 1-环己烯酸CoA还原酶在聚酮类化合物起始单位-1-环己羧酸CoA合成中起关键作用。构建Streptomyces asukeensis279571-环己烯酸CoA还原酶基因(chcA)的表达载体pLS701并测定该还原酶活性:最适温度为30℃,最适pH值7.5,最适酶浓度10 nM,最适底物浓度50μM,Km值25/μM,kcat值104/min。chcA基因的克隆和研究为克隆1-环己羧酸CoA生物合成基因簇提供了基础。