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卵孢菌素(oosporein)是具有广谱抗菌活性的二联苯醌类化合物;为提高卵孢菌素高产突变株角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20发酵产卵孢菌素的产量,并了解高产突变株CH21-20与出发菌株CH21间发酵代谢的基因表达差异,本研究对卵孢菌素发酵培养条件进行了优化,并通过比较转录组学分析了高产突变株CH21-20与出发菌株CH21间发酵产卵孢菌素的基因表达差异情况。文章共由2部分组成: 第一部分:卵孢菌素高产突变株角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20发酵培养条件优化研究 角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20为本实验室通过遗传改良获得的卵孢菌素高产菌株。本研究对该菌株斜面生孢培养基成分进行了优化,获得适合该菌株的斜面生孢培养基成分为:土豆浸出汁200.0g/L,葡萄糖20.0g/L,琼脂20.0g/L,羧甲基纤维素钠1.5g/L。利用该斜面生孢培养基培养角毛壳菌CH21-20,孢子成熟时间由28天缩短至17天;在4℃储存条件下,从第0天至第14天,孢子萌发率由52.6%增加至78.3%,之后处于下降趋势,至第60天时,孢子萌发率维持在36.9%左右。 对角毛壳菌CH21-20发酵培养条件进行了研究,结果显示其最适发酵条件为:转种量(体积分数)3%、初始发酵pH7.0、装液量为60mL/250mL三角瓶、摇床转速180r/min、培养温度24℃。培养基碳、氮源、无机盐筛选结果表明:15.0g/L蔗糖、5.0g/L蛋白粉及0.5g/L氯化钠能显著提高卵孢菌素产量。以卵孢菌素为响应值,对蔗糖、蛋白粉、氯化钠进行了三因素三水平的Box-Behnken实验设计及响应面法优化研究;通过方差分析显著性及求解回归方程得到蔗糖、蛋白粉及氯化钠的最佳配比分别为:15.63g/L、5.22g/L、0.53g/L,预测在此发酵条件下卵孢菌素最高产量可达2547.41μg/mL,实验验证得到卵孢菌素产量为2478.56μg/mL,与预测值接近;发酵条件优化后,卵孢菌素产量较优化前提高了56.11%。 第二部分:比较转录组学分析高产突变株角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20与出发菌株CH21相关基因表达差异 研究了高产突变株CH21-20及出发菌株CH21在相同发酵培养条件下各自的生长规律及卵孢菌素合成代谢规律,并以此为依据,选择发酵培养过程中菌株不同生长阶段的7个时间点共42个样本,提取Total-RNA后进行全转录组测序。 对高产突变株CH21-20及出发菌株CH21全转录组测序结果进行了比较转录组学初步分析。结果发现:碳、氮源代谢相关基因表达在高产突变株CH21-20与出发菌株CH21间存在较大差异。整个发酵过程中,淀粉及蔗糖代谢途径中α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、海藻糖-6-磷酸合成酶及内切葡聚糖酶等相关基因的表达在高产突变株CH21-20中明显上调;在发酵前54h,6-磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、己糖激酶及丙酮酸激酶等参与糖酵解过程相关基因的表达在高产突变株CH21-20中较出发菌株CH21中明显上调,发酵54h之后,则明显下调。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的限速酶,磷酸葡萄糖变位酶影响葡萄糖-6-磷酸在该反应中的代谢方向,在整个发酵过程中,这两个基因的表达在高产突变株CH21-20中明显下调。以上结果说明高产突变株CH21-20与出发菌株CH21对碳源的利用存在显著差异。氮调控蛋白基因(AreA)及氮同源转录因子基因(NirA)调节不同氮源条件下与氮源利用相关基因的表达,是氮代谢模型中重要的基因。亚硝酸盐/硝酸盐转运子属于主要易化子超家族(Major Facilitator Superfamily,MFS)参与将胞外氮转运至胞内过程。在整个发酵过程中,这三个基因在高产突变株CH21-20中的表达显著低于在出发菌株CH21中的表达,说明高产突变株CH21-20对氮源的代谢不同于出发菌株CH21。 本研究对于卵孢菌素高产突变株和出发菌株在发酵过程中与碳氮源代谢利用的相关基因表达差异有了初步的认识,为后期进一步深入分析卵孢菌素合成机理及调控机制的研究提供基础。