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脑缺血损伤时，组织会释放大量游离的兴奋性氨基酸，主要是谷氨酸，它们作用于突触后膜的谷氨酸受体N-methyl-D-aspartate（NMDA），使其过度激活，通过谷氨酸受体依赖的离子通道开放引起钙超载，导致神经元发生坏死或凋亡，加重继发性脑损伤。由于神经元内缺乏可降解谷氨酸的酶类，所以谷氨酸的清除主要是依靠神经元和胶质细胞膜上的谷氨酸转运系统。谷氨酸被神经元和胶质细胞膜上的兴奋性谷氨酸转运体（EAATs）转运至细胞内，在谷氨酰胺合成酶的作用下转化为谷氨酰胺，后者再被转运回神经元内[1]。EAATs分为EAAT1-5型，其中EAAT2在皮层和纹状体较丰富，且仅表达于胶质细胞。脑缺血损伤时，谷氨酸转运体的90%由EAAT2完成，是最主要的谷氨酸转运体[2]。大鼠脑卒中后给予电针治疗，可以显著增加EAAT2的表达水平，增强谷氨酸的重摄取功能，产生神经保护作用[3]。我们前期研究发现，电针(Electroacupuncture，EA)预处理可以激活大鼠脑缺血组织中CB2受体发挥神经保护作用[4]。据报道，小胶质细胞和星形胶质细胞均有CB2受体表达[5]。同时，本课题组前期试验利用细胞培养技术，发现给予CB2受体激动剂AM1241预处理可以减轻脂多糖（LPS）和γ-干扰素（IFN-γ）引起的小胶质细胞活化和损伤作用[6]；同时也可以减轻由谷氨酸介导引起的小胶质细胞活化和损伤作用[7]。电针预处理产生的神经保护作用已明确与CB2受体相关。与此同时，电针治疗作用又与调节谷氨酸摄取和降解有关，但目前关于电针预处理激活CB2受体后如何发挥作用还不清楚，因此，我们推测电针预处理激活CB2受体可能作用于EAAT2发挥神经保护作用。本实验利用C57BL/6小鼠全脑缺血损伤模型，对此假说进行验证。实验一EAAT2在电针预处理诱导神经保护的研究目的：验证电针预处理作用，观察EAAT2是否参与电针预处理诱导的神经保护作用。方法：成年雄性C57BL/6小鼠64只，随机分为8组（n=8）：假手术组（Sham组）、对照组（Con组）、头孢曲松钠组（Ceftriaxone Sodium，CXT组）、溶剂组（V组）、电针预处理组（EA组）、Dihydrokainate+电针组（DHK+EA组）、DHK溶剂+电针组（V+EA组）和DHK组。CXT组术前连续5d腹腔注射CXT600mg/kg，V组给予等容量CXT溶剂生理盐水0.1mL，DHK组缺血前1h侧脑室单次注射DHK200ug/kg；EA组、DHK+EA和V+EA组麻醉后接受电针刺激百会穴，选用疏密波、频率2/15Hz、电流强度1mA，30min/天，连续5天。除Sham组外，各组动物处理完成后24h用双侧颈总动脉阻塞（BCCAO）方法制备小鼠全脑缺血再灌注损伤模型，缺血20min。DHK+EA组和V+EA组分别于缺血前1h侧脑室注射DHK200ug/kg或等容量溶剂生理盐水2uL。各组动物再灌注24h后行神经行为学评分，然后处死，取脑组织，HE染色，光镜下观察细胞形态，进行海马CA1区损伤神经元计数。结果：1. EAAT2激动剂CXT预处理可以减轻C57BL/6小鼠的全脑缺血损伤小鼠神经行为学评分和海马CA1区组织病理学结果：与Sham组比较，Con组小鼠神经功能学评分显著降低（P<0.05），损伤神经元数目增多（P<0.05）；与Con组比较，CXT组可明显增加神经行为学评分（P<0.05），减少损伤神经元细胞数目（P<0.05），V组神经功能学评分和损伤的神经元数目没有变化（P>0.05）。2. EAAT2拮抗剂DHK可以逆转电针预处理产生的脑缺血耐受作用小鼠神经行为学评分和CA1区组织病理学结果：与Sham组比较，Con组神经功能学评分显著降低（P<0.05），损伤神经元数目增多（P<0.05）；与Con组比较，EA组和V+EA组可明显提高神经行为学评分（P<0.05），降低损伤神经元的数目（P<0.05）；与EA组比较，DHK+EA组神经行为学评分明显降低（P<0.05），损伤神经元数目增加（P<0.05），但V+EA组与EA组比较，的神经功能学评分没有改变和损伤神经元数目也没有差异（P>0.05）。结论：电针预处理可改善脑缺血损伤作用，提高小鼠神经行为学评分和降低损伤神经元的数目。脑缺血前给予EAAT2的拮抗剂DHK可以明显逆转电针预处理的神经保护作用。而EAAT2激动剂CXT预处理也可增加全脑缺血模型小鼠的神经行为学评分和降低损伤神经元的数目，提示EAAT2参与了电针预处理诱导产生的神经保护作用。实验二CB2R/EAAT2在电针预处理诱导脑缺血耐受作用的研究目的：验证CB2参与电针预处理产生的脑缺血耐受作用，进一步探讨电针预处理激活CB2受体后是否调节胶质细胞膜上的EAAT2发挥脑缺血耐受作用。方法：成年雄性C57BL/6小鼠136只，随机分为11组：Sham组、Con组、EA组、AM630+EA组、溶剂+电针组（V+EA组）、AM1241组、溶剂组（V组）、ACEA组、AM251+EA组、AM630组和AM251组。AM1241组、ACEA组、V组、AM630组和AM251组分别于缺血前连续5d腹腔注射AM1241、ACEA或等容量溶剂，AM6303mg/kg和AM2511mg/kg；EA组、AM630+EA组、AM251+EA组和V+EA组麻醉后接受电针刺激百会穴，参数同实验一，并于电针前3h和30min分别腹腔注射AM251和AM630及其溶剂。处理完成后24h制备小鼠全脑缺血再灌注损伤模型，缺血20min。每组各取6只采用Western blotting方法检测EAAT2蛋白表达。另外Sham组、Con组、EA组、AM630+EA组、V+EA组和AM630组各取14只：每组8只再灌注24h神经行为学评分后处死小鼠，取脑组织，HE染色，光镜下计数海马CA1区损伤神经元数目；每组6只，再灌注24h利用免疫荧光法检测EAAT2和星形胶质细胞特异性标记物-胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）共标记的细胞数目。结果：1. CB2受体拮抗剂AM630逆转电针预处理的神经保护作用小鼠神经行为学评分和CA1区组织病理学结果：与Sham组比较，Con组小鼠神经功能学评分显著降低(P<0.05)，损伤的神经元数目也明显增多(P<0.05)；与Con组比较，EA组和V+EA组小鼠神经行为学评分明显增加(P<0.05)，损伤的神经元数目减少(P<0.05)；与EA组比较，AM630+EA组小鼠神经行为评分降低(P<0.05)，损伤神经元数目也明显增多(P<0.05)，而V+EA组这两项指标没有差异(P>0.05)。2. CB2受体激动剂AM1241预处理上调脑缺血组织EAAT2蛋白表达，CB2受体拮抗剂AM630逆转电针预处理的上调EAAT2蛋白表达作用Western blotting结果：与Sham组比较，Con组EAAT2表达虽有所升高，但没有统计学意义(P>0.05)；与Con组比较，EA组和V+EA组EAAT2的蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；与EA组比较，AM630+EA组EAAT2蛋白表达水平下降(P<0.05)，而V+EA组没有统计学差异(P>0.05)。与Con组比较，AM1241组EAAT2表达水平明显上调(P<0.05)，V组没有统计学差异(P>0.05)。3.电针预处理上调脑缺血区GFAP和EAAT2蛋白表达水平，CB2受体拮抗剂AM630可以逆转此作用免疫荧光双标染色结果和Western blotting结果一致。Sham组和全脑缺血再灌注24h的Con组都表达EAAT2，两组之间没有显著性差异；电针预处理后EAAT2的表达明显多于Con组，AM630+EA组弱于EA组。Sham组和Con组GFAP强度没有差异，EA组GFAP明显强于Con组和AM630+EA组。EAAT2-GFAP双标记的阳性细胞，同样也是EA组明显强于Con组，而AM630+EA组减弱。4. CB1受体激动剂ACEA预处理对全脑缺血EAAT2蛋白表达水平没有影响，CB1受体拮抗剂AM251也未逆转电针预处理引起的EAAT2蛋白表达上调。Western blotting结果：与Sham组比较，Con组EAAT2表达虽有所升高，但没有统计学意义(P>0.05)；与Con组比较，EA组和V+EA组EAAT2的蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；与EA组比较，AM251+EA组EAAT2蛋白水平虽有所下调，但没有统计学差异(P>0.05)，V+EA组同样(P>0.05)。与Con组比较，ACEA组和V组的EAAT2蛋白表达水平没有统计学差异(P>0.05)结论：1.神经功能学评分和病理组织学结果证明：CB2受体拮抗剂AM630可以逆转电针预处理的神经保护作用；Western blotting和免疫荧光结果显示：AM630逆转了电针预处理引起EAAT2-GFAP阳性细胞数的增多，CB2受体激动剂AM1241预处理也上调EAAT2蛋白表达水平，提示电针预处理是通过CB2R/EAAT2发挥神经保护作用的。2. CB1受体未参与电针预处理对EAAT2蛋白表达水平的调节。小结本实验结果显示EAAT2参与了电针预处理诱导的脑缺血耐受作用。进一步实验结果提示电针预处理激活CB2受体后可以上调星形胶质细胞膜上的EAAT2发挥脑缺血耐受作用。因此本实验提出电针预处理诱导产生脑缺血耐受作用机制的新通路：CB2R/EAAT2。