角质细胞生长因子-1((?)eratinocyte growth factor-1, KGF-1即FGF7),是目前对皮肤损伤修复最有效且特异性最好的成纤维细胞生长因子家族(FGFs)成员之一。KGF-1来源于间质细胞,通过旁分泌方式作用于不同组织来源的上皮细胞,其生理功能主要表现在上皮形态功能的发生、伤口表皮细胞的再生、毛囊的生长和器官的形态发生等方面。临床应用于放化疗后的口腔黏膜炎的治疗,以及一些潜在应用有糖尿病等代谢性疾病引起的慢性伤口愈合、早产儿的主要障碍-表面活性剂的不足和支气管肺发育不良、急性肺损伤的治疗、急性肝损伤的保护及再生等。但是由于KGF-1蛋白表达量(E. coli)(?)低且稳定性差,一直制约着KGF-1蛋白在药物上的研发进程。KGF-1也曾在哺乳动物细胞、植物细胞中尝试表达,但是表达量和稳定性仍然没有得到解决。因此,亟需一种新的方法解决KGF-1的生产问题。昆虫细胞-杆状病毒表达系统(IC-BEVS)在近30年来得到了迅速应用,目前用于商业化表达重组疫苗和药用蛋白,该系统具有表达速度快,可以表达相对较大的目的蛋白,不含有动物病原体,并可以对真核来源的蛋白进行翻译后修饰,活性与天然蛋白类似等优点。因此,本论文使用昆虫细胞作为生物反应器,进行重组KGF-1在昆虫细胞中表达,根据KGF-1蛋白的特点和昆虫表达系统的特性进行研究。首先,从基因水平入手,为了提高KGF-1的表达量,对KGF-1基因进行改造,根据昆虫偏好密码子的使用规律,同时考虑mRNA的结构对翻译及稳定性的影响进行基因优化。其次,由于KGF-1蛋白的不稳定性,根据现有的报道对KGF-1蛋白的N-端氨基酸进行截短,设计3种形式的KGF-1蛋白的病毒载体,并对其天然的信号肽序列在昆虫细胞反应器中发挥的功能进行分析；此外,IC-BEVS系统是瞬时裂解表达系统,蛋白表达条件及收获时间直接影响重组蛋白的质量和产量。因此,对不同形式的rhKGF-1蛋白的表达条件进行优化,并利用KGF-1具有肝素亲和特性进行纯化；最后,对重组的rhKGF-1蛋白的活性进行研究,进行体外活性实验,通过MTT法对rhKGF-1蛋白促HaCat细胞和BaF3细胞的增殖进行研究；体内活性实验通过对急性肝损伤的保护进行验证,并探讨其不同形式的KGF-1蛋白活性的异同。通过对上述内容的研究,得到以下结论：1.3种形式的KGF-1基因经昆虫偏好密码子优化后在昆虫细胞中均得到表达(即rhKGF-1194, rhKGF-1163, rhKGF-1140),但表达方式略有不同。KGF-1天然的信号肽可以在昆虫细胞中发挥作用,帮助蛋白分泌到胞外,缩短了rhKGF-1194蛋白的表达时间。2.不同MOI转染细胞对细胞毒害及蛋白产量均有显著影响,不同的收获时间对细胞的产量存在显著影响。最佳的MOI值约在1-3之间,胞内表达在84-96h收获,分泌表达条件下在48-60h收获最佳。3.3种不同形式的目的蛋白稳定性有差异,rhKGF-1140的稳定性好于rhKGF-1194和rhKGF-1163,rhKGF-1194和rhKGF-1163在储存过程中出现降解,从20kDa均降到17kDa左右,大小与rhKGF-1140相接近。4.纯化后的蛋白都具有促细胞有丝分裂活性,其中rhKGF-1140的活性优于rhKGF-1194和rhKGF-1163。5.rhKGF-1对急性肝损伤的保护作用。3种形式的rhKGF-1蛋白对小鼠急性肝损伤均有保护作用,其中rhKGF-1140蛋白的作用最明显,而rhbFGF对小鼠急性肝损伤有保护作用但效果不明显；同时,体外实验表明：rhKGF-1对CC14诱导的HL7702肝细胞损伤有保护作用,初步判断其保护作用是通过减少细胞坏死和抑制细胞凋亡来实现的。通过本研究初步建立昆虫细胞表达rhKGF-1蛋白的表达优化条件,可以认为rhKGF-1在昆虫细胞反应器中表达是可行的,同时也发现rhKGF-1在纯化和储存过程中不稳定发生降解的问题。本论文的研究为大规模利用昆虫细胞生产rhKGF-1蛋白奠定了基础。但是,由于本研究的条件优化仅限于小规模摇床表达,在使用wave或发酵罐进行放大规模表达时还需要进一步对细胞密度、溶氧、pH值、培养基营养等条件进行摸索,尤其是培养基的成本非常高,据报道自制新型的无血清培养基会大大的降低生产成本10-20倍,所以,实现大规模生产hKGF-1还需要进一步深入和系统的研究。