结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,转移是导致患者死亡的最重要的原因,也是结直肠癌术后复发的直接原因。结直肠癌的演进是多因素,多水平,多通路的复杂过程。因此,筛选其发生、转移相关基因并阐明其相关分子机制,将对临床结直肠癌的诊断、预防、治疗具有重要意义。促肝细胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3, PRL-3),属于蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase)家族(PRL-1、PRL-2、PRL-3)成员,其蛋白的相对分子量约为19KD,它通过调节酪氨酸残基的磷酸化状态实现对蛋白质活性的调控。目前证实PRL-3与人结直肠癌的发生、进展、转移及预后密切相关。PRL-3在正常结直肠上皮中几乎不表达,在原发性结直肠癌肿瘤组织中不表达或低表达,而在结直肠癌转移灶(尤其是肝脏)中高表达。PRL-3的上调与肿瘤的转移密切相关。PRL-3是细胞粘附和上皮间叶转化的重要的调节因子,通过增强整合素相关Src信号及PI-3K/AKT信号通路促进EMT (epithelial msenchymal transition)的发生,调节RhoGTP酶家族信号通路、细胞周期等。我们的前期课题实验结果发现PRL-3可直接调节钙粘附蛋白(Cadherin)促进EMT发生。除此之外,PRL-3也是重要的细胞周期调节因子。但其相互作用的底物仍然不太清楚。Integrin a 1是最先报道的与PRL-3相互作用蛋白,我们课题组通过酵母双杂交技术及免疫共沉淀方法筛选并证实PRL-3另一相互作用蛋白CDH22；国外通过蛋白组学方法成功筛选出PRL-3部分作用底物及相互作用蛋白——ezrin、cytokeratin 8、the elongation factor 2 (EF2)。为了进一步了解PRL-3在结直肠癌发生、转移中的功能和作用,我们运用蛋白组学策略检测PRL-3瞬时敲低24小时、48小时及稳定敲低结直肠癌细胞后蛋白水平的改变,运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometer,MALDI-TOF MS)技术鉴定出39个差异表达蛋白；其中我们发现致癌基因Stathmin随着PRL-3的敲低而表达下调。Stathmin是一种小分子磷蛋白,分子量约17KD,为微管不稳定蛋白,与肿瘤的浸润、转移密切相关,在本研究中我们将通过免疫共沉淀、免疫荧光、构建干扰及过表达载体后生物学功能等方面对两者之间的相互作用作进一步研究。生长状态良好的人结直肠癌细胞株SW480、瞬时敲低PRL-3 24小时及48小时的SW480细胞、稳定敲低PRL-3的SW480细胞克隆共四组,分别获取细胞全蛋白后,行双向凝胶电泳技术筛选PRL-3相关的差异蛋白点,通过MALDI-TOF MS分析鉴定相关蛋白。随机获取149例新鲜人结直肠癌组织石蜡包埋后4μm切片,免疫组织化学染色检测Stathmin的表达,Western Blot分析不同人结直肠癌细胞株中Stathmin的表达,Western Blot分析人结直肠癌组织与其配对正常粘膜组织中Stathmin的表达。设计人Stathmin特异性引物,克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染结直肠癌细胞SW480及HT29,应用Western Blot检测Stathmin蛋白的表达；设计人Stathmin基因特异性RNAi靶序列,克隆至pGPU6/GFP/Neo siRNA表达载体,应用PCR及DNA测序进行鉴定,确认后转染入结直肠癌细胞SW620及Lovo,应用Western Blot检测不同干扰片段对Stathmin蛋白表达的影响。利用MTT法、平板克隆形成实验检测Stathmin过表达对结直肠癌细胞SW480、HT29体外增殖能力的影响及Stathmin敲低后对结直肠癌细胞SW620及Lovo体外增殖的影响；应用运动小室实验检测Stathmin过表达对结直肠癌细胞SW480、HT29运动和迁移能力的影响及Stathmin敲低后对结直肠癌细胞SW620及Lovo迁移能力的影响；应用细胞粘附实验测定Stathmin过表达对结直肠癌细胞SW480、HT29粘附能力的影响及Stathmin敲低对结直肠癌细胞SW620、Lovo粘附能力的影响。生长状态良好的人结直肠癌细胞株SW620、Lovo、SW480、HT29免疫荧光标记后共聚焦分析PRL-3与Stathmin在结直肠癌细胞内的共定位；收集人结直肠癌细胞及结直肠癌组织蛋白后行免疫共沉淀法进一步鉴定PRL-3与Stathmin在结直肠癌细胞及组织中的相互作用。免疫荧光及Western Blot观察PRL-3与Stathmin过表达对结直肠癌细胞SW480、HT29中α-tubulin及乙酰化α-tubulin的分布和表达的影响,敲低PRL-3与Stathmin对结直肠癌细胞SW620、Lovoα-tubulin及乙酰化α-tubulin的分布和表达的影响。在四个比较组中,通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(Two—Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis,2-DE)结合MALDI-TOF MS技术成功鉴定了39个有差异的蛋白点,其中21个蛋白点在瞬时转染24小时、48小时及稳定敲低的SW480细胞株中均表达下调；9个蛋白点在瞬时转染24小时、48小时及稳定敲低的SW480细胞株中均表达上调；3个蛋白点只在稳定敲低的SW480细胞株中表达下调；6个蛋白点只在稳定敲低的SW480细胞株中表达上调。有意义的是,癌基因Stathmin/OP18随着PRL-3的表达下调而下调。免疫组织化学染色结果显示Stathmin定位于结直肠癌细胞胞浆；正常结直肠组织Stathmin不表达或弱表达,结直肠癌组织中Stathmin的表达明显高于正常结直肠组织；在淋巴结与肝脏转移灶中Stathmin强表达。Stathmin的表达与性别、年龄、肿瘤的大小及范围差异无统计学意义(P>0.05)；但是,Stathmin的表达与结直肠癌患者肿瘤的分化(χ2=6.656,P=0.010)、浸润(χ2=7.762,P=0.05)、淋巴结转移(χ2=33.888,P=0.000)、Dukes分级(χ2=37.480,P=0.000)、TNM分期(χ2=42.155,P=0.000)之间差异有统计学意义。Kaplan-Meier分析方法及Log-rank test发现Stathmin的表达与结直肠癌患者的生存时间存在显著相关性(χ2=53.205,P=0.000)；采用多变量COX回归分析患者生存时间与肿瘤浸润、分化、Duke’s分级、TNM分期、Stathmin表达的关系。结果显示Stathmin表达可作为结直肠癌患者预后的一个潜在的独立预测因子(χ2=48.012,P=0.000)。在随机挑选的4对结直肠癌组织及其配对正常粘膜组织中Western Blot结果显示Stathmin表达在原发结直肠癌组织中明显高于其配对正常粘膜组织；在发生转移的原发结直肠癌组织中Stathmin的表达明显高于未发生转移的原发结直肠癌组织。在不同的结直肠癌细胞株中,在转移能力较强的细胞株SW620、Lovo、HCT116中Stathmin的表达较强；而在低转移潜能的细胞株SW480、HT29、LS174T中Stathmin的表达较弱。MTT法检测结果表明结直肠癌细胞SW480(F=22.236,P=0.000)、HT29(F=93.138,P=0.000)Stathmin过表达后细胞体外生长增殖能力较对照组相比,其生长能力明显增强,差异具有统计学意义。Stathmin瞬时敲低对Lovo细胞(F=19.599,P=0.000)、SW620细胞(F=16.791,P=0.000)体外增殖能力影响与对照组相比,前者细胞的增殖能力明显大于后者,且差异具有统计学意义。平板克隆形成实验显示Stathmin过表达后SW480细胞(F=113.958,P=0.000)、HT29细胞(F=33.477,P=0.000)细胞克隆形成能力明显增强,Stathmin瞬时敲低后Lovo细胞(F=31.172,P=0.001)、SW620细胞(F=30.258,P=0.001)细胞克隆形成能力显著下降,差异具有显著的统计学意义。粘附实验结果表明,Stathmin过表达后SW480细胞(F=24.567,P=0.000)、HT29细胞(F=90.259,P=0.000)粘附能力明显增强,Stathmin瞬时敲低后Lovo细胞(F=11.088,P=0.000)、SW620细胞(F=12.387,P=0.000)粘附能力显著下降,差异具有显著的统计学意义。Transwell小室表明,Stathmin过表达后SW480细胞(F=36.154,P=0.000)、HT29细胞(F=6.568,P=0.033)迁移能力明显增强,Stathmin瞬时敲低后Lovo细胞(F=38.866,P=0.000)、SW620细胞(F=52.068,P=0.000)迁移能力显著下降,差异具有显著的统计学意义。免疫共沉淀分析结果表明,在不同结直肠细胞株中和不同结直肠癌组织中PRL-3与Stathmin存在直接相互作用；在不同结直肠癌细胞株SW480、SW620、LOVO、HT29细胞中PRL-3与Stathmin共定位分析也支持二者存在相互作用。微管是细胞骨架的主要构成成分之一,由α-tubulin及β-tubulin组成微管蛋白二聚体。体内细胞可通过改变微管蛋白的表达,转录后修饰等方式来调节微管的动力学平衡。我们知道Stathmin的主要功能是调节微管的稳定性,因此我们通过观察tubulin及乙酰化tubulin来观察微管的改变。结果表明在不同人结直肠癌细胞株的对照组中,α-tubulin弥散分布于整个细胞,然而,在人结直肠癌细胞株SW480、HT29中,上调PRL-3及Stathmin的表达,α-tubulin的分布呈现聚集倾向；在人结直肠癌细胞株SW620、LOVO中,下调PRL-3及Stathmin的表达,α-tubulin的分布无显著差异性改变。在细胞株SW480、HT29中Stathmin过表达后,acetylated-α-tubulin的表达下调；在细胞株SW620、Lovo中Stathmin表达敲低后,acetylated-α-tubulin的表达上调。上调或下调PRL-3的表达结果与Stathmin一致。Western Blot检测不同人结直肠癌细胞株转染PRL-3与Stathmin过表达或干扰载体后α-tubulin和乙酰化α-tubulin的蛋白表达,发现结直肠癌细胞中PRL-3与Stathmin过表达或干扰后其α-tubulin表达无明显变化,而PRL-3与Stathmin过表达的结直肠癌细胞SW480、HT29乙酰化α-tubulin的表达较对照组相比明显降低,PRL-3与Stathmin敲低的结直肠癌细胞SW620、Lovo乙酰化α-tubulin的表达较对照组相比明显增高,与免疫荧光观察结果一致。1.应用蛋白组学策略成功筛选出39个PRL-3调节相关蛋白,其中Stathmin/OP18蛋白随着PRL-3表达的下调而下调；2. Stathmin/OP18在结直肠癌组织及淋巴结和转移灶组织中的表达明显高于正常结直肠粘膜组织；发生转移的结直肠癌组织中stathmin的表达明显高于未发生转移的结直肠癌组织,可作为结直肠癌患者预后的一个潜在的独立预测因子；3. Stathmin/OP18促进结直肠癌细胞的增殖、迁移、粘附；4.在结直肠癌细胞中Stathmin是PRL-3相互作用蛋白,二者共同作用促进微管解聚促进结直肠癌进展和转移。