前言与目的恶性胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,肿瘤细胞迅速增殖、高度侵袭以及新生血管生成是胶质瘤的基本特征。其中,肿瘤细胞高度侵袭是胶质瘤高死亡率的主要原因,同时也是胶质瘤的典型的生物学标志。胶质瘤细胞侵袭的过程主要包括肿瘤细胞粘附到细胞外基质(Extracellular matrix,ECM),ECM成分的降解,以及随后的肿瘤细胞穿透进入邻近的脑组织。围绕着肿瘤侵袭机制的研究一直以来就是胶质瘤研究的重点。目前观点认为,细胞外基质降解酶系统如基质金属蛋白酶家族(Matrix metalloproteinases,MMPs)等参与了ECM的降解过程。MMPs是锌离子依赖的限制性内切酶,MMPs家族在各种生理病理条件下的ECM的降解过程中均发挥了重要的作用。许多研究表明MMPs能够促进肿瘤细胞侵袭入正常组织和促进肿瘤的转移,MMPs表达水平与恶性胶质瘤的侵袭程度密切相关。其中,由于明胶酶(MMP-2,MMP-9)能够裂解Ⅳ型胶原—构成基底膜的主要成分,因此其在胶质瘤侵袭机制中的作用研究日益成为研究的热点。越来越多的证据表明,在胶质瘤内部存在着一组具有干细胞特性的小的细胞集群-肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs),胶质瘤CSCs具有自我更新、多向分化以及体内成瘤的能力,可以分化成多种细胞成分,参与肿瘤的发生发展机制,并且与肿瘤的化疗耐药性及放疗抗性密切相关,因此在胶质瘤的发生发展进程中发挥了决定性的作用。但是就胶质瘤CSCs本身的侵袭特性的研究尚未见报道。本研究中我们成功分离并鉴定多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)细胞系U87、9L、原代培养细胞系GBM1的CSCs;探讨胶质瘤CSCs与非肿瘤干细胞(non-CSCs)的侵袭情况,明确两种细胞亚群的侵袭能力的差异;以及MMP-2、MMP-9表达在GBM的CSCs侵袭机制中的作用,为以CSCs为靶点的胶质瘤治疗方案的筛选提供有力的理论和实验依据。方法1实验材料肿瘤组织取自洛杉矶Cedars-Sinai医学中心神经外科手术标本,经病理诊断证实为GBM。GBM细胞系U87、9L细胞系购自美国ATCC(American Tumor CellCollection)。DMEM/F12培养液、B27(一种干细胞培养补充剂)购自Invitrogen公司,肝素(Heparin)购自Sigma公司,人表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)和碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)购自R&DSystems公司。盒式载玻片(Chamber Slides)购自Electron Microscopy Sciences公司。免疫荧光抗体采用:小鼠抗人CD133单抗(1:10,Milteny Biotec),小鼠抗人nestin单抗,小鼠抗人β-mbulinⅢ单抗(1:200,Chemicon),兔抗人GFAP多抗,小鼠抗人myelin/oligodendrocyte单抗(1:1000,Chemicon),Cy3标记的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(1:200,Jackson Immuno Reserech)。细胞侵袭分析试剂盒(ECM550,聚碳酸酯膜,8-μm孔径)购自Chemicon公司(Temecula,CA)。免疫组织化学染色采用:小鼠抗人MMP-2和MMP-9单克隆抗体购自Calbiochem公司(SanDiego,CA)。6-8周龄的免疫缺陷裸鼠、成年雄性F344大鼠(重量200g～220 g),由洛杉矶Cedars-Sinai医学中心实验动物中心提供。2实验方法2.1 CSCs培养分离:肿瘤标本经清洗、剪碎、胰酶消化,滤网过滤收集细胞。淋巴细胞分离液除去其中的红细胞,U87、9L细胞系细胞先用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的DMEM/F12培养液培养扩增,后转至含EGF和bFGF的无血清培养液(DMEM/F12)培养,形成细胞球。2.2有限稀释法:收集细胞球细胞稀释后培养观察单细胞克隆能力,检测细胞球细胞的自我更新能力。细胞球再经胰酶消化成单细胞,于盒式载玻片中应用含血清培养基进行培养,观察细胞球细胞的多向分化情况。2.3免疫荧光染色:细胞球细胞及分化的肿瘤细胞固定后,分别滴加干细胞表面特异性标记物,Cy3标记二抗,荧光显微镜下观察细胞分化情况。2.4细胞颅内种植:应用Stoeling脑立体定向注射仪,将50,000个细胞球细胞或非细胞球细胞定向注入裸鼠右侧纹状体。21天后处死裸鼠,取脑组织观察评价不同亚群肿瘤细胞的颅内成瘤能力。2.5体外细胞侵袭能力的测定:分别收集细胞球细胞和非细胞球细胞,应用细胞侵袭分析试剂盒,计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数,以穿膜细胞的数目表示细胞侵袭力的大小。2.6 H&E染色:如上述方法进行颅内种植,分别于接种后不同时间点14天、21天、28天处死裸鼠,制作16-μm脑组织冰冻切片,观察颅内新生肿瘤的浸润和侵袭性生长情况。2.7免疫组织化学:冰冻切片,应用MMP-2、MMP-9抗体,采用SABC法检测MMP-2、MMP-9在裸鼠脑组织内的表达情况。2.8实时定量RT-PCR:采用RNeasy试剂盒(QIAGEN)分别提取细胞及组织的总RNA,逆转录成cDNA后,应用Icycler PCR仪(BIO-RAD,Hercules,CA)行PCR反应。相对mRNA表达水平对比两种细胞亚群的基因表达差异,以及新生脑肿瘤组织中的MMP-2和MMP-9的表达差异。2.9 Western blot检测:提取细胞及组织的总蛋白,紫外分光光度法蛋白定量。4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE胶中(Invitrogen)电泳,转印至PVDF膜后,分别加入MMP-2和MMP-9一抗,后加入相应的HRP标记的二抗,显色系统显色。β-actin为内参照。2.10统计学分析:统计学处理应用SPSS13.0软件。采用双尾Student’s t检验,数值以均数±标准差表示。以P＜0.05为有统计学意义。实验结果1 CSCs特性分析显示:原代细胞球细胞在有限的传代条件下形成了2代细胞球;表达了神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)的标记物(CD133和Nestin);这些细胞能够分化成为多种同源子细胞(神经元、星形细胞、少突胶质细胞);经裸鼠颅内种植后形成了新生肿瘤。相反,小于0.5%的非细胞球细胞显示CD133和Nestin的阳性表达,且不具备自我更新、多向分化及颅内成瘤的特性。基于以上结果,我们将这两种细胞亚群定义为:肿瘤干细胞(CSCs)和非肿瘤干细胞(non-CSCs)。2不同细胞亚群的体外侵袭能力评估显示:CSCs的穿膜细胞数明显多于non-CSCs(GBM1:1106±45,450±12;U87:1194±71,471±22;9L:1270±108,421±13),其差异有统计学意义(P＜0.01)。且前者在穿膜之后再次形成细胞球。3 MMP-2和MMP-9在不同细胞亚群中的表达1)实时RT-PCR结果显示,在三个肿瘤细胞组中,CSCs的CD133、Nestin、MMP-2 mRNA的表达水平明显高于non-CSCs(以non-CSCs的值设定为1),CD133(27.6±2.92;23.4±3.57;24.5±1.21);Nestin(22.3±1.12;21.7±1.78;23.8±4.27);MMP-2(297.4±25.3;193.7±31.2;201.6±19.9),但是MMP-9的mRNA表达水平在两个细胞亚群中无明显差异,而且其表达水平显著低于MMP-2 mRNA(5.4±0.47;4.9±0.32;5.1±0.39)。2) Western blot结果显示,在三组CSCs亚群中,MMP-2表达均为阳性,MMP-9仅在GBM1组的CSCs中有微弱表达;在三组non-CSCs亚群中,MMP-2均为阳性表达且表达强度弱于CSCs组,而MMP-9均为阴性表达。4不同细胞亚群体内侵袭情况比较在三个肿瘤细胞组中,经细胞球细胞接种的裸鼠脑组织内均形成高度增殖和侵袭的肿瘤,并伴有广泛的血管生成。相反,在非细胞球细胞接种的动物组中,除在6只9L细胞接种裸鼠中有2只形成了小的颅内肿瘤外,其余实验动物均未形成肿瘤。5 MMP-2和MMP-9在颅内新生肿瘤组织中的表达1)免疫组化结果显示,MMP-2阳性表达定位于正常脑组织和肿瘤组织中,尤其特异性表达于肿瘤的中心;相反,MMP-9阳性表达定位在肿瘤的边缘,且在正常脑组织中极少表达。2)实时RT-PCR结果显示,在正常脑组织中,MMP-2 mRNA有微弱表达(每组中的正常脑组织表达均设为参照值1),而MMP-9 mRNA未见表达;在肿瘤组织中,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平均随肿瘤生长时间明显升高,尤其28天组较14天组其差异有统计学意义(P＜0.0001)(14d/28d:4.96±0.09/27.58±1.07;5.2±0.43/27.09±1.68;3.71±0.56/26.61±1.29),而且MMP-9 mRNA表达水平的升高比例高于MMP-2(MMP-9/MMP-2:2.14±0.25,P＜0.001)。3) Western blot结果显示,MMP-2在肿瘤组织中表达阳性,在正常脑组织中微弱表达;相反,MMP-9仅在肿瘤组织中阳性表达。与RT-PCR结果一致,两者的表达水平随肿瘤生长而明显升高,特别是将28天组与14天组进行对比,MMP-9的表达变化尤为明显。结论1 GBM细胞球细胞具有CSCs的特性,具有自我更新、多向分化以及体内成瘤的能力可以作为理想的CSCs进行深入研究。2在体内及体外条件下,胶质瘤CSCs表现出较non-CSCs明显增强的侵袭能力。胶质瘤CSCs极大地促进了肿瘤的侵袭能力,至少部分是因为胶质瘤CSCs同时拥有了肿瘤细胞和NSCs的特性,它们在胶质瘤的成瘤过程中发挥了关键的作用,胶质瘤CSCs也许是通过促进肿瘤细胞的侵袭从而促进肿瘤的形成和进展。3胶质瘤CSCs在体外条件下,主要是通过上调MMP-2的表达促进肿瘤细胞的侵袭和迁移;而在体内条件下,MMP-9对肿瘤的侵袭性生长也许起到了更为重要的作用。因此,胶质瘤CSCs也许是通过明胶酶依赖的机制在不同的条件下促进了肿瘤细胞的侵袭和肿瘤的侵袭性进展。