【摘 要】
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背景和目的脑小血管病（cerebral small vessel disease,CSVD）是指由各种病因影响脑小动脉、微动脉、毛细血管、微静脉和小静脉所引起的病变。CSVD与卒中和痴呆的风险呈正相关,严重危害中老年人健康,给社会带来了沉重负担,但因缺乏可靠的动物模型,其发病机制仍不清楚,且缺乏确实有效治疗手段。目前认为血脑屏障（blood brain barrier,BBB）损伤是影响CSVD发
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背景和目的脑小血管病（cerebral small vessel disease,CSVD）是指由各种病因影响脑小动脉、微动脉、毛细血管、微静脉和小静脉所引起的病变。CSVD与卒中和痴呆的风险呈正相关,严重危害中老年人健康,给社会带来了沉重负担,但因缺乏可靠的动物模型,其发病机制仍不清楚,且缺乏确实有效治疗手段。目前认为血脑屏障（blood brain barrier,BBB）损伤是影响CSVD发生和发展重要因素,如何防控BBB损伤也成为治疗的焦点。NOTCH3基因突变引起的常染色体显性遗传性脑动脉病合并皮质下梗死和白质脑病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL）是最常见的单基因遗传性CSVD,且存在血脑屏障损伤,解析其发病机制有助于推进对CSVD的整体认识。前期我们团队构建了NOTCH3基因R544C点突变模型鼠（R544C点突变小鼠）,并发现其BBB结构破坏,基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）表达增加。查阅文献可知MMP-9可降解细胞外基质,从而破坏BBB完整性,但MMP-9增多的机制少有报道。为了探究CADASIL中MMP-9增多的作用及机制,本研究将通过R544C点突变小鼠,明确该点突变是否通过NF-κB和/或AKT/c-Jun信号通路来调控MMP-9表达,进而破坏BBB。以期为CSVD的发生机制提供新的理论依据,为治疗提供新的靶点。方法1、通过CRISPR/Cas9技术,构建与人NOTCH3基因R544C点突变对应同源的模型鼠。2、通过伊文思蓝渗漏实验检测R544C点突变小鼠大脑和小脑伊文思蓝的渗出量及渗出部位,同时用Western blot和免疫荧光染色观察白蛋白的渗漏情况,反映血脑屏障通透性;眼底荧光造影检测血-视网膜屏障通透性。3、Western blot和免疫荧光染色观察MMP-9和TIMP-1表达情况及其细胞定位。针对R544C点突变小鼠脑损伤情况,利用q-PCR、Western blot、免疫荧光染色等方法检测NF-κB、c-Jun和AKT等信号通路指标。结果1、同WT小鼠相比,R544C点突变小鼠大脑和小脑的伊文思蓝渗漏量分别增加96.11±33.83%（P<0.05）和61.91±13.95%（P<0.001）,白蛋白含量增加30.13±9.26%（P<0.001）。2、9月龄的WT小鼠和R544C点突变小鼠的眼底荧光造影未见造影剂渗漏。3、R544C点突变小鼠皮层和海马MMP-9含量较WT小鼠增加,增多的MMP-9与神经元存在共定位,而与星形胶质细胞及小胶质细胞无共定位。4、与WT小鼠相比,R544C点突变小鼠的TIMP-1水平降低11.22±4.90%（P<0.05）,MMP-9/TIMP-1比值增加50.45±22.25%（P<0.05）。5、与WT小鼠相比,R544C点突变小鼠NF-κB（P65）m RNA增加52.72±19.29%（P<0.05）、c-Jun m RNA增加42.3±17.94%（P<0.05）,但免疫荧光未见NF-κB（P65）入核,NF-κB、c-Jun和AKT蛋白含量有减少趋势,均无统计学差异。结论1、NOTCH3基因R544C点突变小鼠BBB通透性增加。2、NOTCH3基因R544C点突变小鼠MMP-9/TIMP-1表达失衡,可能是BBB通透性增加的原因。3、NOTCH3基因R544C点突变小鼠中增多的MMP-9并非由Notch3/NF-κB和Notch3/AKT/c-Jun信号通路调控。
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