氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate,EC）为2A类致癌物,天然存在于部分酒精饮料（如黄酒）中。黄酒因EC存在而产生的食品安全问题越来越受到人们的关注。酶法（氨基甲酸乙酯水解酶及酸性脲酶）降解EC及其前体物尿素,具有直接、高效的特性而成为控制黄酒EC含量的方法中最有效方法之一。然而,目前所发现的EC水解酶在酸性或乙醇存在条件下不稳定、对EC亲和力低,酸性脲酶产量低、需Ni²⁺作为辅助因子而带来的食品安全问题,使得其尚无法在黄酒中应用。因此,在本论文中,首先鉴定出来源于Bacillus paralicheniformis ATCC 9945A的脲酶（BpUrease）为含有Fe的酸性脲酶且能够降解EC;其次通过分子改造的手段强化BpUrease对黄酒中EC的降解能力;最终提高BpUrease在食品级表达系统Bacillus subtilis TEA/pTTB中的表达量,为BpUrease的工业化应用打下基础。主要研究结果如下:（1）发现BpUrease具有EC水解能力。B.paralicheniformis的EC水解酶在含有20%（v/v）乙醇的缓冲液中,37^oC保温2 h后,可以保留64%的酶活力。对该酶经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、疏水层析、高分辨率阴离子交换层析及凝胶过滤层析等五个步骤进行了纯化,纯度提高了105倍,回收率为5.5%,酶的比活力达10.5 U·mg^-1。对纯化的酶进行质谱鉴定（MALDI-TOF/MS）,发现该酶为脲酶。（2）发现及鉴定了BpUrease为Ni²⁺、Fe离子均可螯合的金属酶。通过BpUrease在E.coli BL21（DE3）中异源表达及酶活力测定,证实了其EC降解能力。分析NiSO₄,FeCl₃,MnCl₂,CuSO₄及CoSO₄等金属盐对重组E.coli发酵产脲酶活力的影响,发现仅在添加NiSO₄及FeCl₃时,重组E.coli才能实现BpUrease的高活力表达。在结构亚基BpUreC的N端融合亲和纯化标签蛋白Strep-tag,实现了脲酶的纯化。经native PAGE检测,该脲酶分子量约为220 kDa,为（UreABC）₃结构。纯化的酶金属离子含量测定后发现,每个BpUrease（Fe）及BpUrease(Ni²⁺)分子活性中心分别含有0.3个Fe或1.9个Ni,证实了BpUrease的金属离子依赖型并不专一,它是一种Ni²⁺、Fe离子均可螯合的金属酶。（3）证明了BpUreH的功能为向胞内转运Ni²⁺及Fe³⁺,发现BpUreae对EC的亲和力弱是导致其不能降解黄酒中EC的关键性因素。比较脲酶基因簇,发现BpUrease相对于其它来源的脲酶基因簇中多出一个基因BpureH。敲除BpureH后,重组E.coli脲酶活力下降了75%。对表达了BpureH的重组E.coli胞内金属离子含量的测定,证明了BpUreH的功能为向胞内转运Ni²⁺及Fe³⁺。进一步对BpUrease酶学性质分析,发现BpUreae（Fe）及BpUreae(Ni²⁺)的最适温度及pH均相同,以尿素为底物时,分别为50^oC及5.0,以EC为底物时,分别为45^oC及7.0。两种酶均在温度低于50^oC或pH 6.0-8.0的范围内稳定。两种酶在含有15%（v/v）乙醇中37^oC加热2h,均可保持65%及以上的酶活力。BpUreae(Ni²⁺)对EC及尿素的K_m及k_cat/K_m值分别为1018及23.7 mM,425及1.2 E+05s^-1·M^-1。BpUreae（Fe）对EC及尿素的K_m及k_cat/K_m值分别为958及28.2 mM,58及9557s^-1·M^-1。BpUreae（Fe）对底物催化效率远低于BpUreae(Ni²⁺)。两种酶对EC的底物亲和力及催化效率均远低于以尿素为底物时的亲和力及催化效率。添加6000 U·L^-1的酶,37^oC反应50 h后,BpUreae（Fe）及BpUreae(Ni²⁺)可分别降解黄酒中92.1,94.3%的尿素,但对EC无明显的降解,可能是由于该酶对EC的底物亲和力差。（4）通过分子改造手段提高了BpUrease对EC的亲和力及催化效率。对BpUreC位于底物进出口通道及活性中心附近的16个氨基酸进行单点饱和突变及筛选,发现Leu253及Leu287为影响BpUrease对EC催化的关键性氨基酸。相对于野生型,变体L253P、L287I及L287N对EC的k_cat/K_m值分别提高了418、333及721%,突变体L287N对EC的K_m值下降了37.5%。双突变体L253P/L287N对EC的K_m及k_cat/K_m值分别为521 mM及4788 s^-1·M^-1,其K_m下降了51%,k_cat/K_m提高了1080%。结构分析发现,Leu253位点位于底物进出通道的入口,Leu253Pro的突变,间接影响了Arg339与催化氨基酸His323之间的相互作用。Leu287位点位于底物结合口袋的内部,Leu287Ile及Leu287Asn的突变导致活性位点附近氨基酸之间相互作用力发生变化。添加10 U·mL^-1纯化的酶,20^oC反应50 h后,突变体L287N及L253P/L287N可分别降解黄酒中30.9及37.1%的EC,这主要是由于突变体对EC的底物亲和力增强。（5）实现了BpUrease的食品级制备。在食品级表达系统B.subtilis TEA/pTTB中表达Bpurease原始基因簇时,摇瓶发酵水平的脲酶活力为38 U·L^-1。在各基因间插入核糖体结合位点（AGGAGG）并重新组装基因簇后,重组菌的酶活力达到187 U·L^-1,提高了390%。将基因簇中ureC调整于ureAB前,从而强化BpUreC的表达后,重组菌的酶活力达到530 U·L^-1,进一步提高了183%。使用P_asd启动子强化Fe³⁺转运蛋白BpUreH的表达后,重组菌的脲酶活力达到1307 U·L^-1,再次提高了147%。通过在3-L发酵罐上恒速补加葡萄糖,重组菌脲酶活力达到21964 U·L^-1。这是目前为止所报道的食品级宿主所生产的脲酶的最高产量。