【摘 要】
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钙缺乏已成为困扰人类健康的全球性营养问题,而补充钙制剂对维持骨代谢平衡、预防或减轻骨质疏松症等骨骼代谢疾病具有重要意义。食源性钙离子结合肽是一类高效低毒的新型钙制剂,具有正向调控骨代谢、增强成骨细胞活性的潜能。然而,目前关于植物基钙离子结合肽对成骨细胞活性影响的研究较少,且其活性组分的结构及作用机制尚不明晰。基于此,本论文以黑豆蛋白为对象,借助酶解技术和特征指纹图谱,鉴定并解析钙离子结合肽的结构及
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钙缺乏已成为困扰人类健康的全球性营养问题,而补充钙制剂对维持骨代谢平衡、预防或减轻骨质疏松症等骨骼代谢疾病具有重要意义。食源性钙离子结合肽是一类高效低毒的新型钙制剂,具有正向调控骨代谢、增强成骨细胞活性的潜能。然而,目前关于植物基钙离子结合肽对成骨细胞活性影响的研究较少,且其活性组分的结构及作用机制尚不明晰。基于此,本论文以黑豆蛋白为对象,借助酶解技术和特征指纹图谱,鉴定并解析钙离子结合肽的结构及其钙结合机理,进而利用MC3T3-E1细胞模型探究其成骨活性及作用机制,旨在为植物基钙制剂的开发提供科学依据。主要结果如下:首先,采用酶解技术制备系列黑豆蛋白酶解产物,评价其钙离子结合活性及结构特征。结果表明,四种蛋白酶制备的水解产物的钙离子结合活性为无花果蛋白酶>碱性蛋白酶>菠萝蛋白酶>胰蛋白酶;无花果蛋白酶的最佳酶解参数为p H 6.2,酶浓度1.61%（w/v）,温度70°C,水解时间3 h,该条件下制备的黑豆蛋白水解产物（BPHs）的钙离子结合活性为77.54±1.61μg/mg。结合钙离子前后的BPHs结构变化明显,主要表现为:复合物（BPHs-Ca）的天冬氨酸和谷氨酸含量较BPHs显著增加（p<0.05）;相较于BPHs,BPHs-Ca的紫外吸光值和荧光强度明显降低,红外吸收峰发生偏移,推测其主要结合位点为羧基氧原子和氨基氮原子;BPHs表面呈现光滑的片层结构,而BPHs-Ca表面呈现出不规则的粗糙球形颗粒。其次,利用高效液相色谱（HPLC）构建特征指纹图谱,鉴定并表征钙离子结合肽的结构与活性。结果表明,图谱中获得28个共有特征峰,其中特征峰2和4的钙离子结合活性最强,分别为91.02±4.37μg/mg和98.84±7.04μg/mg;经液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析,特征峰2和4分别鉴定出31条和67条肽段,分子量范围为307.1～3301.5 Da;筛选出TVVP、LTP、DIV、ITDI、NIDI、TISSENI、IEI、CVE等低分子量且结构中无消化酶作用位点的8条肽段,测定其钙离子结合活性的范围为110.56±4.10～161.52±3.64μg/mg。借助分子对接技术解析肽钙结合机理,发现上述8条肽段可与钙离子形成结构稳定的复合物,其中NIDI的结合模式为α模式,而其他7条肽段的结合模式为单齿模式;肽结合钙的主要位点为肽链末端氨基酸的羧基氧原子。最后,研究了黑豆源钙离子结合肽对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化能力的影响,并探究其成骨活性的作用机制。结果表明,BPHs和CVE对细胞的增殖、分化及矿化过程均有显著的促进作用,主要表现为:细胞增殖阶段,BPHs和CVE对MC3T3-E1细胞的促增殖效果呈现一定的浓度和时间依赖性,其细胞增殖率高达162.56±20.03%和147.99±12.70%;细胞分化阶段,BPHs和CVE可显著提高细胞碱性磷酸酶（ALP）的活性（p<0.05）,分化7 d时,CVE浓度的变化（0.1～100μM）影响不显著,而BPHs浓度为200μg/m L时细胞的ALP活性增长率达最高值（460.14±8.20%）;细胞矿化阶段,BPHs和CVE均可提高细胞外基质的矿化水平（p<0.05）,其中前者表现出明显的浓度依赖性,CVE与4 m M Ca Cl2联用时对MC3T3-E1细胞的矿化具有协同作用,联用组的矿化水平高于单独使用时的效果。此外,BPHs和CVE可显著提高BMPs、Smads以及成骨特异性转录因子Runx2和Osterix的表达水平（p<0.05）,上调ALP、OC等分化相关基因的表达,推测BPHs和CVE可能通过BMP/Smad信号通路促进MC3T3-E1细胞的成骨活性。
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