氨肽酶（Aminopeptidases,EC 3.4.11）能够去除蛋白质或多肽N-末端氨基酸,广泛应用于食品加工、饲料生产、活性肽制备等领域,尤其是耐热氨肽酶的应用前景更加广阔。课题组前期从铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）GF31中分离纯化得到了一种活性较高的胞外亮氨酸氨肽酶（PLAP）,同时能够降解拟除虫菊酯。本文将PLAP在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行了克隆表达,以进一步研究该酶的特性、作用机制及其实际应用的潜力。（1）为了解决前期研究中菌株GF31氨肽酶PLAP难以在大肠杆菌中获得可溶性表达的问题,本文优化了其编码基因aps的密码子并采用周质表达的方式在大肠杆菌中进行表达,构建了表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）-p ET22b（+）-aps,成功实现了重组PLAP的可溶性表达。随后,研究获得最优表达条件为:宿主菌选用Rosseta gami2（DE3）,IPTG终浓度为1 m M,诱导温度为20℃,诱导时间为12 h。由此,该酶在大肠杆菌中的表达情况为在周质空间占比42%,在胞内占比49.7%。利用Co2+-NTA结合弱阴离子层析得到了纯化酶,比活力为6.8 U/mg。（2）测定了重组PLAP的酶学性质。最适反应温度为80℃,在50-70℃具有良好的热稳定性;最适反应p H为8.0,在p H 7.0-9.0的范围内较为稳定。Co2+对酶活力有强烈的激活作用,Zn2+、Ni2+、Fe2+有一定的抑制作用。还原剂（DTT、β-疏基乙醇）对该酶有强烈的抑制作用;金属离子络合剂（EDTA-Na2、1,10-邻菲咯啉）对酶活力也具有较强的抑制作用,表明该酶属于金属氨肽酶。Bestatin作为金属氨肽酶特异性抑制剂对其酶活力有较强的抑制作用,PMSF则基本没有抑制作用。重组PLAP可在高浓度盐溶液及部分有机溶剂中保持稳定。底物特异性表明重组PLAP对Leu-p NA、Met-p NA水解效果最好,对Arg-p NA、Ala-p NA的水解效果一般;而对Glu-p NA、Pro-p NA、Phe-p NA基本没有水解活性。动力学分析显示该酶以Leu-p NA为底物的Km为1.11 mmol/L,Vmax为101.01μmol/（L·min）;以Met-p NA为底物的Km为2.30 mmol/L,Vmax为92.59μmol/（L·min）。酯水解能力分析表明重组PLAP对癸酸对硝基苯酯水解效果最好,对其他几种酯的水解效果一般。（3）对PLAP进行氨基酸序列对比分析,结果表明该酶与其他M28家族氨肽酶有相同的保守位点,其中PLAP蛋白序列的Glu305、Ser387以及His260是催化三元体,与Zn2+配位的氨基酸分别是His260、Asp272、Glu305、Asp333、His431。通过Alpha Fold2构建三维模型,发现该酶由PA结构域和催化结构域构成。在对氨肽酶抑制剂Bestatin和癸酸对硝基苯酯的分子对接结果分析中发现活性中心的GLU304、ASP272等氨基酸对酶与底物的结合起到关键作用。（4）将重组PLAP运用于复配水解玉米蛋白和拟除虫菊酯农药降解。筛选出碱性蛋白酶用于水解玉米蛋白,在最优条件下（60℃,p H=10.0,加酶量为1%,底物浓度5%）可获得20%的水解度;进一步将碱性蛋白酶与重组PLAP复配,在最佳氨肽酶加入量为1%时水解度可提高到36%,而且水解液中Asp、Ala、Met、Leu、Arg、Phe等氨基酸含量显著增加。在菊酯农药的降解方面,重组PLAP在60℃,48 h内对50 mg/L高效氯氰菊酯的降解率为53%;对于顺式氯氰菊酯、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯均有一定的降解效果。