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目的:本研究筛选了p53基因状态不同的两种人肺腺癌细胞系,以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将野生型p53基因cDNA分别导入这两种细胞,并在细胞内获得表达后,观察p53基因的放射增敏作用,并探讨其机制,为临床开展基因放射治疗提供实验依据。 方法:本实验分为三部分。第一部分选取人肺腺癌细胞系A549及GLC-82细胞,通过免疫组化法检测内源性P53蛋白的表达、继而通过PCR-SSCP方法检测细胞中内在p53基因的状态。第二部分以携带外源性野生型p53基因cDNA及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷型重组体腺病毒为载体,将外源性wtp53分别转入这两种细胞内,通过绿色荧光蛋白及P53免疫组化检测,观察转染效率及外源性基因在细胞内的表达,并选择最佳转染滴度;以含半乳糖苷酶的复制缺陷型腺病毒空载体(Ad-LacZ)为对照,绘制细胞生长曲线,观察wtp53对两种细胞系生长的影响。第三部分以Ad-p53转染两种细胞后,分别给予OGy、2Gy、4Gy不同剂量照射,测定集落形成率,并应用流式细胞仪技术检测外源p53基因对照射后细胞周期及凋亡的影响,应用SPSS10.0统计软件包对结果进行分析。 结果:Ad-p53转染前A549细胞免疫组化染色呈阳性表达,GLC-82细胞呈阴性表达,PCR-SSCP结果提示GLC-82细胞存在p53基因第七外显子突变。转染后24小时A549细胞免疫组化染色阳性表达增强,GLC-82细胞由阴性表达转为阳性,表明wtp53在细胞内成功的表达。绿色荧光蛋白检测显示100MOI腺病毒载体转染后16小时可达70-80%表达,转染效率高,以100MOI为最佳转染滴度。细胞生存曲线显示Ad-p53对两种细胞系体外生长均有抑制作用,而对GLC-82细胞抑制作用强于A549细胞。两种细胞转染Ad-p53并给予不同剂量照射后的集落形成能力明显下降,随着剂量的增加,下降更为明显;在同一照射剂量下,转染Ad-p53组细胞的集落形成能力最低。单独照射或单独转染Ad-p53都可以使细胞周期阻滞于G1期并使凋亡指数增高,Ad-p53结合放疗组的作用更为明显,各组之间有极显著性差异(p<0.001);分析Ad-p53加照射组的G1期阻滞与凋亡指数 硕_卜研究生学位论文发现二者呈正相关,表明Ad一p53对放射的增敏作用是通过Gl期阻滞并诱导凋亡而实现的,而且这一作用不依赖于内源p53基因的状态。 结论:研究结果表明腺病毒载体可有效的将外源Wtp53基因转入人肺腺癌细胞,wtp53可以抑制肺腺癌细胞的恶性生长,在体外结合放射可以提高肺腺癌细胞的放射敏感性,其机制在于wtp53可使细胞周期阻滞于Gl期,并促进放射诱导的凋亡;wtp53的放射增敏作用不依赖于细胞内源p53基因状态。