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研究背景种子细胞来源是限制软骨组织工程应用于临床的关键问题。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ASCs)来源丰富,取材容易,体外倍增速度快,免疫原性低,有望成为组织工程与再生医学的理想种子细胞来源。然而脂肪组织经酶消化后,得到的是基质血管部分(Stromal vascular fraction, SVF),其中具有多向分化潜能的干细胞所占的比例较小,成软骨能力较弱,需要对其进行分离纯化,提高ASCs的比例。新鲜分离的干细胞中高表达CD34,通过流式分选技术,采用CD34和CD31这两个标志物对SVF进行流式细胞分选(CD34+CD31-),并将分离纯化的ASCs用于组织工程化软骨的构建,为优化软骨组织工程种子细胞提供理论依据。研究目的从脂肪组织中分离纯化CD34+CD31-细胞亚群,比较CD34+CD31-细胞亚群与未分选细胞的表面标志,证实流式细胞分选CD34+CD31-细胞是分离纯化ASCs的有效方法,并对CD34+CD31-细胞亚群与SVF进行成软骨相关检测,验证CD34+CD31-细胞亚群的成软骨潜能。研究内容1、脂肪干细胞的分离纯化与表面标志鉴定方法：将脂肪抽吸术得到的脂肪组织经胶原酶消化得到新鲜分离的SVF,对其进行流式细胞分选,分选出CD34+CD31-的细胞亚群,即人脂肪干细胞(Human adipose-derived stem cells, hASCs), 对 hASCs(CD34+CD31-)和未分选细胞(SVF)的进行干细胞表面标志物的流式分析。结果：新鲜分离的SVF中CD34表达率约为88.37%。采用CD34和CD31 (CD34+CD31ˉ)对新鲜分离的SVF进行分选,CD34+CD31-亚群约占66.74%且随年龄增大,比例有所升高。CD34+CD31-亚群表面CD44、CD90、CD73均呈阳性表达,且明显高于SVF,CD45、CD105均为阴性表达。2、二维培养条件下验证1iASCs (CD34+CD31-)的成软骨潜能方法：将分选出的hASCs (CD34+CD31-)和SVF分别在二维(单层培养)条件下进行成软骨诱导,通过Real-time PCR检测成软骨相关基因Aggrecan和II型胶原及软骨肥大基因X型胶原的表达,甲苯胺蓝和免疫组化染色对软骨基质及II型胶原进行半定量检测,比较hASCs(CD34+CD31-)和未分选细胞的成软骨潜能。结果：hASCs(CD34+CD31-)和SVF在成软骨诱导14天后,Aggrecan、Ⅱ型胶原及X型胶原表达量均上调,两者相对表达量无差异,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色均为阳性,二者积分光密度无统计学差异。3、三维培养条件下验证hASCs(CD34+CD31-)的成软骨潜能方法：将分选出的hASCs(CD34+CD31-)和SVF分别在三维(pellet)条件下进行成软骨诱导,进行大体观察、HE、甲苯胺蓝、番红O及免疫组化染色,并检测GAG含量,比较hASCs(CD34+CD31-)和未分选细胞的成软骨潜能。结果：1hASCs(CD34+CD31-)组在三维条件下成软骨诱导28天后,形成的pellet较SVF组更接近软骨组织形态, 甲苯胺蓝、番红O及II型胶原染色均为阳性,积分光密度均高于SVF组,GAG含量两组无统计学差异。结论1、新鲜分离的SVF中高表达CD34,年龄因素不影响SVF中CD34的表达。与SVF相比,采用流式分选得到的CD34+CD31-亚群高表达干细胞表面标志物,因而认为通过流式分选可成功分离纯化hASCs.CD34+CD31-亚群比例随年龄增长有升高趋势。2、在二维培养条件下,hASCs(CD34+CD31-)与SVF均能被成功诱导向软骨方向分化,而二者在成软骨相关基因的表达,及软骨基质的合成方面并无明显差异。3、在体外三维培养条件下,hASCs(CD34+CD31-)可被诱导向软骨方向分化,其大体观及组织学染色半定量检测均优于SVF,可初步认为hASCs(CD34+CD31-)在体外的成软骨能力优于SVF。