研究背景人表皮生长因子受体家族包含有4个成员,分别为HER1/EGFR、HER2/neu、 HER3和HER4。它们的分子结构相似,其中HER2在其他成员的活化中起着核心作用。HER2基因定位于人类第17号染色体长臂上,其编码的蛋白质为分子量185kDa的单链跨膜糖蛋白(称为p185蛋白),包括胞外域、跨膜域和胞内域,其胞内域具有酪氨酸激酶(PTK)活性和自身磷酸化位点。当不同的配体与HER2胞外配体结合区结合后,受体二聚体化,激活自身酪氨酸激酶,引起一系列级联瀑布式的信号传导,激活下游的STAT、PI3K/AKT/mTOR、Ras/Raf/MAPK信号通路,从而影响包括细胞生长、代谢、增殖、凋亡和分化等多种细胞生物学功能。随着对肿瘤发生发展过程中分子生物学机制的不断深入研究,在包括胃癌在内的多种肿瘤细胞中发现HER2高表达,且其表达水平与肿瘤的发生发展、治疗反应及预后密切相关。曲妥珠单抗(Trastuzumab,商品名：Herceptin)是一种抗HER2的人源化单克隆抗体,主要通过拮抗HER2信号传导通路而抑制HER2过表达的肿瘤细胞生长、增殖。目前曲妥珠单抗己成功用于治疗HER2过表达的转移性乳腺癌和胃癌,并且取得了良好的疗效。其可能的作用机制包括：(1)抑制PI3K/AKT信号通路的激活；(2)通过上调细胞周期负性调节蛋白如p27kip1诱导细胞周期G1期停滞；(3)抑制HER2的胞外域脱落；(4)抑制HER2二聚体化；(5)介导了抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)等途径。尽管曲妥珠单抗联合化疗用于转移性胃癌已取得了良好的疗效,但大多数对曲妥珠单抗敏感的患者在开始用药后一年内产生耐药。目前关于曲妥珠单抗耐药机制的研究多集中于乳腺癌,基于其作用机制肿瘤细胞通过多种突变方式促使PI3K/AKT信号通路的持续活化从而获得耐药性。其可能的机制包括(1)PTEN的丢失：PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是目前研究较为广泛的一种抑癌基因,中文名为第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白的同源基因。PI3K/AKT信号通路是细胞将胞外生长因子信号传递至胞内的关键通路,负责调节细胞的代谢、生存、增殖和肿瘤发生。而PTEN则主要通过负性调节胞内PI3K/AKT信号通路来发挥其抑癌作用。目前研究发现PTEN在乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤细胞中出现高频率突变。此外,仍有研究报道PTEN突变不仅在肿瘤的发生发展中起着关键作用而且在机体对抗肿瘤药物的治疗反应上也产生了重要影响。在细胞学水平上的研究已证实HER2阳性的乳腺癌细胞中AKT的组成性激活削弱了曲妥珠单抗对PI3K/AKT通路的抑制及对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p27kip1的促进作用,从而减弱了曲妥珠单抗介导的生长抑制和凋亡。(2) PIK3CA的激活性突变：PI3K催化亚基p110a编码基因PIK3CA的激活性突变使得PI3K持续拥有催化活性激活AKT同样导致了PI3K/AKT通路的组成性激活,从而形成曲妥珠单抗的耐药。(3) IGF-1R旁路的激活：除了PTEN丢失、PIK3CA的激活性突变外,生长因子介导的PI3K/AKT的激活也能促进耐药的产生。其中已有研究报道的生长因子通路包括胰岛素样生长因子I型受体(IGF-1R).稳定过表达IGF-1R使HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗由敏感转变为耐药。而在药物抑制了IGF-1R后,则PI3K信号通路的活化水平相应降低,重建了细胞对曲妥珠单抗的敏感性。由于细胞信号转导是一个多因素、多环节、交叉联系的网络调控系统,且肿瘤细胞群体生长分数高,基因组稳定性差,因此在使用了针对某一特定分子的靶向药后,在各种内外源性刺激因子的作用下,肿瘤细胞群体持续不断地动态演进,交互式的信号网络调控体系相互作用,激活了新的生长信号转导通路从而产生耐药。因此,基于精准医学治疗原则在肿瘤药物治疗中的应用,不仅需要在药物使用前明确肿瘤组织的相应分子生物学诊断,也需要通过“液体活检”等手段持续关注研究后续治疗中各种相关信号通路的基因突变,从而探明其耐药机制再据此设计更为有效的治疗方案以更好地杀灭肿瘤细胞达到控制病情进展甚至是治愈的目的。研究目的和意义：由于曲妥珠单抗联合化疗用于治疗晚期胃癌患者的客观有效率仍然不足50%,且大部分接受曲妥珠单抗治疗初始有效的患者往往在一年内产生继发性耐药。因此探究曲妥珠单抗的耐药机制继而为逆转耐药提供相应的理论依据具有重要的临床意义。目前在胃癌中曲妥珠单抗的耐药机制仍未阐明,相关文献报道也较少。本实验从细胞及分子水平研究了其耐药机制,为筛选出一种新的曲妥珠单抗耐药的分子指标以确定更优的目标治疗人群及克服耐药奠定了重要的理论基础。材料与方法：1. Western blot法进行HER2阳性人胃癌细胞株的筛选运用Western blot法检测4株人胃癌细胞株SGC7901、MKN45、NCI-N87、 MKN28的HER2蛋白表达水平,筛选出HER2表达阳性的NCI-N87细胞作为本实验的研究对象用于进一步的实验研究。2.逐步增加剂量法诱导人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞通过逐步增加剂量法诱导建立人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞系NCI-N87/TR,以MTT法检测耐药细胞的半药抑制浓度IC50,并计算耐药指数RI。3.耐药细胞对化疗药物的交叉耐药MTT法检测杀代细胞NCI-N87与耐药细胞NCI-N87/TR对5-Fu、DDP、Taxol3种化疗药物的的IC50,并分别计算耐药指数RI。4.耐药细胞中AKT/p-AKT及PTEN基因和(或)蛋白的表达水平应用Western blot法检测亲代细胞NCI-N87与耐药细胞NCI-N87/TR中AKT/p-AKT及PTEN的蛋白表达水平；利用实时荧光定量PCR检测NCI-N87与NCI-N87/TR PTEN基因的表达。5. PI3K/AKT信号通路的活化与曲妥珠单抗耐药的关系分别以PI3K抑制剂LY294002处理或siPI3K转染耐药细胞 NCI-N87/TR,应用Western blot法检测细胞AKT/p-AKT蛋白表达的变化,MTT检测细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。6.PTEN基因转染研究利用DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBabe-puro-PTEN,转化大肠杆菌DH5α,经过菌落PCR检测、酶切鉴定、基因测序等方法鉴定出阳性克隆；将上述鉴定出的重组质粒以Lipofectamine 2000转染耐药细胞NCI-N87/TR;应用Western blot法检测细胞PTEN及下游蛋白AKT/p-AKT的表达水平；MTT检测细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。7.统计学方法所有结果均应用SPSS 21.0统计学软件(IBM Corporation, Armonk, NY, USA)进行处理。所有实验结果至少重复3次,并且计算出平均值,数据以平均值±SEM的形式报告。显著性差异均是通过单因素方差分析或Student’s-T检验分析而得。各实验结果所得P值<0.05被认为是有统计学意义。研究结果1.HER2阳性人胃癌细胞株的筛选对比4株人胃癌细胞株SGC7901、MKN45、NCI-N87、MKN28的HER2蛋白表达水平发现,NCI-N87的HER2蛋白表达量最高,因此我们选择HER2高表达的胃癌细胞NCI-N87作为研究对象进行下一步的耐药细胞诱导建立。2.人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞的诱导建立在对NCI-N87细胞培养的过程中,逐步增加曲妥珠单抗的浓度诱导NCI-N87产生耐药性,当曲妥珠单抗诱导浓度逐渐增加至3500μg/ml时,NCI-N87能够在该培养基中稳定生长并传代,说明己成功诱导建立人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞,命名为NCI-N87/TR;以MTT法检测曲妥珠单抗对NCI-N87和NCI-N87/TR的细胞增殖抑制率,并应用统计学软件SPSS计算相应的半药抑制浓度IC50,计算耐药指数RJ(RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50)；结果提示,NCI-N87和NCI-N87/TR的IC50分别为19.762μg/ml和227.523μg/ml, NCI-N87/TR的耐药指数RJ为11.51。3.耐药细胞对化疗药物的交叉耐药MTT检测结果提示,耐药细胞NCI-N87/TR对Taxol和DDP存在交叉耐药(RI=2.03和2.69,P均为0.000),对5-FU不耐药(RI=0.97,P=0.725)。4.耐药细胞中AKT/p-AKT及PTEN基因和(或)蛋白的表达水平与亲代细胞NCI-N87比较,耐药细胞NCI-N87/TR p-AKT蛋白表达水平显著升高,PTEN蛋白水平显著下降；此外,与NCI-N87比较,NCI-N87/TR PTEN基因表达量显著下降(P=0.000)。5. PI3K/AKT信号通路的活化与曲妥珠单抗耐药的关系分别以PI3K抑制剂LY294002处理以及siPI3K转染耐药细胞NCI-N87/TR,结果提示,NCI-N87/TR中p-AKT蛋白表达显著下降,对曲妥珠单抗的敏感性增强,说明PI3K/AKT信号通路的活化是导致耐药细胞耐药性产生的重要机制之一。6.PTEN基因转染研究Western blot法检测结果显示,与空载体转染相比,PTEN基因转染后,耐药细胞NCI-N87/TR中PTEN蛋白表达显著升高,p-AKT蛋白表达显著下降；MTT检测结果提示,PTEN基因转染后,NCI-N87/TR对曲妥珠单抗的敏感性增强。以上结果说明,耐药细胞PI3K/AKT信号通路的活化与PTEN基因表达下调密切相关,通过PTEN转染,可以增强耐药细胞对曲妥珠单抗的敏感性。研究结论1.通过逐步增加剂量法成功诱导建立人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞NCI-N87/TR, NCI-N87/TR的耐药指数为11.51；NCI-N87/TR对Taxol和DDP存在交叉耐药,对5-FU不耐药。2.在人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞NCI-N87/TR中存在PI3K/AKT信号通路的异常激活,通过抑制耐药细胞PI3K/AKT信号通路的活化,可以恢复耐药细胞对曲妥珠单抗的敏感性,证明PI3K/AKT信号通路的活化是导致耐药细胞耐药性产生的重要机制之一。3.在人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞NCI-N87/TR中同时存在PI3K/AKT通路上游PTEN基因的表达下调,通过PTEN基因转染,可以抑制耐药细胞PI3K/AKT信号通路的活化,说明PTEN基因的表达下调是导致耐药细胞PI3K/AKT信号通路活化的主要原因之一,PTEN基因有望成为胃癌对曲妥珠单抗的耐药指标。