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目的:苹果渣中含有丰富的多糖类物质,但对其系统分析与活性测试鲜有报道。本实验通过从苹果渣中提取、纯化得到苹果多糖,初步探讨其对 LPS诱导巨噬细胞RAW264.7的体外抗炎作用,并从LPS/TLR-4/NF-κB信号转导通路研究其抗炎作用的分子机制。 方法: 1.以苹果果渣为原料,以水提时间(h)、水提次数(次)、乙醇比例(倍)、醇沉次数(次),四因素三水平设计正交实验,优化苹果多糖提取最佳条件,并通过除蛋白、除色素及透析方法初步纯化得到一定分子量苹果多糖。 2.采用硫酸-苯酚法、高相液相色谱法确定苹果多糖的糖含量及相对分子量。 3.采用10μg/ml浓度LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,观察苹果多糖体外抗炎作用。 4.采用ELISA、Q-PCR方法从蛋白和基因水平检测细胞炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表达量。 5.Western blot法检测苹果多糖对NF-κB信号通路中的IκB磷酸化及NF-κB P65蛋白核转位影响;TLR-4蛋白的膜质分布影响。 6.细胞免疫荧光法检测苹果多糖对NF-κB信号通路中NF-κB P65蛋白核转位影响。 结果: 1.正交试验结果表明,以提取时间4 h,提取次数3次,醇沉比例为9倍,醇沉次数为2次。采用除Sevage法去除蛋白,氧化法除色素及透析袋透析,得到糖含量为88.76%,相对分子质量为100000D~200000D的苹果多糖。 2.小鼠巨噬细胞RAW264.7用10μg/ml浓度LPS诱导后,细胞炎症反应模型成功建立,模型细胞细胞培养上清液中的TNF-α、IL-6炎性因子的表达量明显升高,与正常组比较存在着显著性差异。 3.与LPS诱导炎症模型组比较,不同浓度的苹果多糖在蛋白和基因水平都能够明显的降低炎症模型细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6细胞促炎因子的表达量;显著提高炎症模型细胞中IL-10抗炎因子的表达。 4.苹果多糖能够显著降低NF-κB信号通路中IκB磷酸化水平,提高IκB蛋白表达;显著降低NF-κB P65核转位。 5.苹果多糖能够显著影响 LPS诱导巨噬细胞 TLR-4蛋白的膜质分布。 结论: 1.苹果多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型具有良好的抗炎作用。 2.苹果多糖通过作用于 TLR4/NF-κB信号通路,影响 TLR-4的膜质分布,进而影响NF-κB P65核转位,抑制相关促炎因子表达,增加抗炎因子IL-10的表达而发挥体外抗炎作用。