股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head, ANFH)是临床多发病和常见病,致残率极高,多见于20-50岁青壮年,严重影响患者的生活质量和劳动能力,给社会和家庭造成巨大负担。据世界卫生组织不完全统计,全世界约有3000万人患有此病；我国患者约500-750万,每年新发病例15-20万,发病率呈逐年上升趋势。ANFH目前尚无特效疗法,已成为世界医学界亟待攻克的难题。寻找新的有效的早期治疗方法、保存自身股骨头显得尤为重要,其潜在的社会和经济效益不言而喻。不论何种病因引起的ANFH,其根本原因是存在骨内压升高→血供障碍这一恶性循环。一般认为本病是一不可逆过程,因此,ANFH的治疗策略应该是早期治疗,降低骨内压、改善股骨头血供,打破恶性循环,同时进行坏死区骨质修复。利用血管生长因子诱导新血管生成和侧枝循环建立,是打破ANFH病理恶性循环最有效的手段,这也为ANFH治疗提供了新的研究方向。血管生长因子是一组可以诱导血管生成的细胞因子。不同的血管生成因子具有不完全相同的生物学活性,因此,选择何种血管生长因子至关重要。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)由问质细胞产生,具有很强的促血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)增殖和促血管生成作用,并可抑制细胞凋亡和减轻组织纤维化,已在治疗缺血性心脏病和肢体动脉闭塞等疾病中展现出良好的应用前景,有望成为治疗ANFH理想的血管生长因子。骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一种由骨髓中分离获得的具有多种分化潜能的间质干细胞,是体内参与组织再生和修复的重要干细胞成分之一,取材方便,易于被外源基因转染,同时还能分泌大量的促细胞和血管生长因子,其成分中含有骨祖细胞,具有良好的向成骨细胞分化的潜能。此外,BMSCs不具免疫原性,因此同种异体移植无免疫排斥反应,被认为是骨组织工程近阶段最有希望应用于临床的种子细胞。目前,用BMSCs治疗早期ANFH已显示出诱人的应用前景。将基因治疗和干细胞移植治疗相结合,用HGF基因修饰BMSCs治疗ANFH,比单用BMSCs具有明显的优势,表现在：(1)BMSCs在发挥其成骨能力的同时分泌HGF,诱导新血管生成,改善股骨头血供；(2)HGF对BMSCs有趋化作用,局部高分泌的HGF可使BMSCs’‘停留”在坏死区局部,利于其向成骨细胞分化：(3)HGF能抑制BMSCs凋亡,其诱生的血管可改善移植细胞的生存环境,提高BMSCs移植存活率,进而提高治疗效果。本课题将基因治疗、干细胞移植、组织工程技术有机结合,以HGF为目的基因、以BMSCs为靶细胞,借助AdMax腺病毒载体系统,将HGF基因转入BMSCs;再以其为种子细胞,经髓芯减压隧道移植到股骨头坏死区,用于治疗早期ANFH。在减压的同时,移植细胞分泌的HGF诱导局部新血管生成和侧枝循环建立,改善股骨头血供；BMSCs在局部微环境诱导下向成骨细胞分化,修复坏死区骨质,这种集减压、血管生成和骨质重建一体化的治疗技术,为ANFH治疗提供了一种全新的模式。目的在体外探讨HGF调节BMSCs增殖与成骨分化活性的方式与机制的基础上,评价HGF基因修饰BMSCs治疗早期激素性和创伤性ANFH的疗效,并初步探讨发病与治疗的分子机理。方法：1、分离培养与鉴定兔BMSCs取4-8周龄健康新西兰大白兔,麻醉后,于双侧髂后上棘行穿刺法抽吸骨髓,抗凝处理后低速离心去上清,以10%FBS-低糖DMEM培养液重悬培养,3d时换液去除未贴壁细胞,其后每3d换液1次；待细胞汇合成单层后消化,传代细胞培养至第二代备用。采用诱导培养基体外诱导BMSCs向成骨细胞、成软骨、脂肪细胞分化。培养12和24天后,磷酸苯二钠基质(NBT-BCIP)法染色和茜素红(AR-S)染色以检测成骨分化水平；培养27天后,阿利新蓝染色以检测成软骨分化水平,油红O染色以检测成脂分化水平；同时以qPCR法检测BMSCs标志基因Vimentin、成骨细胞标志基因Runx2、成软骨细胞标志基因SOX9与脂肪细胞标志基因PPAR-y3mRNA的表达水平。2、体外检测HGF调节BMSCs增殖与分化活性的方式与机制在成骨诱导环境中,以低浓度(20ng/mL)和高浓度(100ng/mL)的HGF处理BMSCs,EdU掺入法检测细胞增殖,WST-8法检测细胞活性；NBT-BCIP法行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色,AR-S法检测钙结节的形成。Western和qPCR检测HGF受体c-Met、细胞分化开关分子——细胞周期抑制分子p27和成骨分化相关转录因子Runx2与Osterix的表达；以ERK信号通路特异性抑制剂PD98059(30lμM)或Akt信号通路特异性抑制剂Wortmannin (100nM)预处理兔BMSCs1h, Western检测信号通路活化水平及其对BMSCs增殖与分化的影响。3、重组腺病毒Ad-HGF转染兔BMSCs,检测HGF的表达和活性重组腺病毒Ad-HGF在293细胞中扩增、氯化铯法超离纯化,TCID50法测定感染性滴度,然后感染BMSCs, RT-PCR、原位杂交、免疫组化检测转染后细胞中HGF的转录和表达。4、兔早期激素性ANFH造模与检测采用马血清注射造成兔过敏性血管炎,再应用大剂量肾上腺糖皮质激素(醋酸泼尼松龙),诱导兔激素性ANFH。4周后利用DR、CT、MRI、动脉墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫组化等多种方法,观察ANFH的影像及病理变化。5、HGF基因修饰BMSCs治疗兔早期激素性ANFH的研究在CT引导下行髓芯减压术,将HGF基因修饰BMSCs经减压隧道移植入兔早期激素性ANFH模型坏死区。治疗后4周,利用DR、CT、MRI、动脉墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫组化等多种检测手段评价疗效,同时设置髓芯减压组为对照。为探讨其机理,以腺病毒空载体转染BMSCs和未转染BMSCs为对照,术后4周,病理切片HE染色评价疗效；术后2天、2周、4周取材,qPCR检测p27、Runx2与Osterix mRNA的表达,免疫组化检测HGF、p-ERK1/2、p-Akt的表达。6、兔早期创伤性ANFH造模与检测采用截断股骨颈的方法造模：逐层切开表皮与肌肉,打开关节囊,切断股骨头周围、含圆韧带在内的血管与韧带,截断股骨颈基底部,使股骨头断端分离3-5min后复位,逐层缝合。术后3天、1周、2周、3周,利用CT、MRI、病理切片HE染色、免疫组化等多种方法,观察ANFH的影像及病理变化。7、HGF基因修饰BMSCs治疗兔早期创伤性ANFH的研究创伤后1周,在CT引导下行髓芯减压术,将HGF基因修饰BMSCs经减压隧道移植入兔早期创伤性ANFH模型坏死区,然后用小夹板固定截断股骨颈。术后4周,利用病理切片HE染色、免疫组化等手段评价疗效,同时设置腺病毒空载体转染BMSCs和未转染BMSCs为对照。为探讨其机理,术后2天、2周、4周取材,免疫组化检测HGF、p-ERK1/2、p-Akt的表达。8、统计学分析所有计量资料结果用x±s表示。EdU法检测信号通路抑制剂处理后BMSCs增殖、WST-8法检测BMSCs活性、NBT-BCIP法检测ALP活性、AR-S染色法检测信号通路抑制剂处理后BMSCs钙结节形成、qPCR检测成骨诱导环境中不同剂量HGF对c-Met、Osterix、Runx2与p27mRNA表达水平的长期影响、IHC检测体内HGF、p-ERK1/2与p-Akt表达水平采用析因设计资料的方差分析；EdU法检测未施信号通路抑制剂处理的BMSCs增殖、AR-S染色法检测钙结节形成、骨髓细胞与股骨头骨髓的面积比、空骨陷窝率、IHC检测体内vWF、CD105、PCNA、Col I、OCN与VEGF的表达应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch校正,在差异显著的前提下进行多重比较,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法。检验水准a=0.05,双侧检验。采用SPSS16.0for windows统计软件包进行数据分析。结果1、成功培养出具有多向分化潜能的兔BMSCs骨髓穿刺法分离、贴壁法纯化成功培养出兔BMSCs,染色法与qPCR检测证实兔BMSCs具有多向分化潜能,可分化为成骨细胞、成软骨细胞与成脂细胞。2、体外探讨HGF调节BMSCs增殖与分化活性的方式与机制①HGF体外调节BMSCs增殖与分化的活性EdU掺入法与WST-8法检测细胞增殖活性,NBT-BCIP法与AR-S法检测细胞成骨分化。结果表明,100ng/mL HGF在成骨诱导环境中促进BMSCs增殖而抑制其向成骨细胞分化,而20ng/mL HGF对BMSCs增殖有所抑制,但显著促进其向成骨细胞分化。②机制研究1：不同剂量HGF对其受体c-Met的表达调控20ng/mL HGF显著提高c-Met的表达与活化水平,而100ng/mL HGF则部分抑制c-Met的表达,且对c-Met的活化效应明显低于20ng/mL HGF。提示不同剂量HGF通过诱导其受体的不同表达与活化水平而产生不同的效应。③机制研究2：不同剂量HGF对ERK与Akt信号通路活化水平的影响100ng/mL HGF通过活化ERK通路、抑制Akt通路活化以显著促进BMSCs的增殖而抑制其成骨分化；20ng/mL HGF则抑制ERK通路、活化Akt通路,从而显著促进BMSCs的成骨分化,但对细胞增殖的促进效应低于100ng/mLHGF的作用效果。提示不同剂量HGF通过活化不同信号通路而产生不同效应。④机制研究3：不同剂量HGF对分化相关转录因子的表达调控在成骨诱导环境中,20ng/mL HGF显著促进BMSCs中p27的表达,并通过提高Osterix与Runx2的表达以促进BMSCs的成骨分化；而100ng/mL HGF对p27的表达具有抑制效应,成骨分化相关转录因子的表达也受到抑制。提示不同剂量HGF通过调控p27、Osterix与Runx2的表达而产生不同的效应。3、Ad-HGF转染的BMSCs表达高水平HGFAd-HGF感染性滴度为2.6x1010TCID50/mL。转染后的BMSCs在mnRNA和蛋白水平均有HGF表达。4、成功建立兔早期激素性ANFH模型DR、CT、MRI、动脉墨汁灌注造影、病理切片HE染色检测结果表明,激素注射后4周,成功制备出兔早期激素性ANFH模型。免疫组化检测新生血管指标--CDl05和组织修复指标--Ⅰ型胶原(ColⅠ),结果提示：激素造模后,股骨头血管生成受抑,成骨反应逐渐减弱,无自身修复现象,4周发展为早期激素性ANFH。5、HGF基因修饰BMSCs治疗兔早期激素性ANFH的研究①疗效评价：影像学和病理组织学检查结果表明,治疗组可显著促进坏死区血管再生和骨质重建,DR显示治疗侧股骨头骨纹理较清楚；CT示点状低密度影数量减少；MRI示点线状高信号影不明显；动脉墨汁灌注造影显示软骨下血管重建,干骺端大血管恢复；病理切片HE染色结果显示骨小梁排列基本规则,骨基质量增多,空骨陷窝少,骨小梁骨板上可见新生毛细血管,边缘有大量成骨细胞,骨髓中造血组织基本恢复。②体内实验机理研究：HGF基因修饰BMSCs治疗组p27、Runx2与Osterix的表达水平最高,表达高峰在移植后2周。HGF的表达水平在ANFH模型组中显著降低,但在HGF基因修饰BMSCs治疗组中达到最高峰,表达高峰出现在移植后2天,ERK1/2信号通路活化水平随之增加,之后二者表达水平逐渐降低。2周后p-Akt的水平逐渐增高,表达峰值出现在移植后4周。上述结果表明,HGF基因修饰BMSCs的HGF表达水平具有与体外相同的变化趋势,并通过与体外相同的机制,即由腺病毒载体介导的HGF体内浓度的有序改变来调控BMSCs增殖与分化,发挥促组织修复与再生的功能。6、成功建立兔早期创伤性ANFH模型影像学与病理组织学检查结果表明,术后3周,成功制备出处于临床ARCOI-II期的兔早期创伤性ANFH模型。病理组织学检查可见骨组织与血管系统发生明显的坏死病变,同时,创伤后2周内可见明显的组织自我修复。CD105、Col I、OCN和PCNA免疫组化检测结果显示,手术截断股骨颈后,股骨头血管生成受抑,组织损伤显著,术后3天有一定程度的自身修复,之后由于血运阻断,修复失败,3周发展为早期创伤性ANFH。7、HGF基因修饰BMSCs治疗兔早期创伤性ANFH的研究病理组织学检查结果表明,HGF基因修饰BMSCs可显著促进创伤组织的恢复,免疫组化检测到ColⅠ的表达模式与未治疗组相反,提示成骨细胞活性增加,同时在治疗组动物中VEGF与CD105表达上调,提示新生血管的发生,进一步证实了BMSCs的疗效。HGF在其中以类似于在激素性ANFH中的机制对BMSCs舌性进行调节,从而促进其修复创伤组织的功能。结论1、获得高表达人HGF基因的BMSCs,为其用于早期ANFH的治疗奠定基础。2、成功诱导了兔早期激素性和创伤性ANFH模型,为进一步研究其发病机理、发展新的有效的早期治疗方法提供了基础,为将来评估新疗法的疗效提供了适宜的平台。3、HGF基因修饰BMSCs联合隧芯减压能有效促进坏死区血管再生和骨质重建,有望成为一种新的ANFH早期治疗手段。可进一步深入探讨HGF浓度改变对BMSCs活性调节的机制,与促进骨再生、提高ANFH疗效,为将来临床应用提供基础。4、创伤性ANFH具有自我修复现象,在适当时机进行干预治疗,与组织自身修复相协同,将有助于提高疗效。