研究背景:淋球菌感染引起的淋病是一种流行率高、可引起较严重并发症的性传播感染性疾病。淋球菌早已进化出对磺胺、青霉素、四环素和氟喹诺酮类药物的耐药性,近年来对一线治疗药物头孢曲松低敏或耐药的菌株也在国内外不断出现,对淋病的有效治疗带来挑战。生物膜是指细菌产生的胞外多聚物（包括多糖、蛋白及胞外DNA等）包裹着细菌群体形成的一种膜性结构。淋球菌已被证明可在体内外形成生物膜,且淋球菌生物膜的形成可降低其对头孢曲松的敏感性。生物膜形成可能是淋球菌重要的耐药机制之一,然而目前缺少生物膜状态下淋球菌耐药性的相关研究,尚不清楚淋球菌生物膜形成对头孢曲松以外其他抗生素耐药性的影响如何,淋球菌生物膜形成的相关机制也并不明确,有待进一步的探索和研究。本研究具体内容包括以下四个部分:第一部分:淋球菌生物膜形成曲线及形成能力测定目的:确定淋球菌生物膜最佳成膜时间,了解淋球菌体外生物膜形成能力,评价结晶紫染色法、激光共聚焦显微镜法检测生物膜形成能力结果的一致性。方法:采集自2019年就诊于本院性病门诊的男性尿道炎患者尿道的淋球菌临床菌株共148株,任选5株临床菌株,利用结晶紫染色法绘制生物膜形成曲线;确定最佳成膜时间后,利用结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜法检测148株临床菌株的生物膜形成能力,质控菌株选择FA1090。Spearman相关性分析用于比较两种生物膜形成能力检测方法的一致性。P＜0.05代表具有统计学差异。结果:淋球菌培养24h所测得的生物膜量最能反应其生物膜形成能力。148株淋球菌临床菌株中,有139株菌（93.92%）可以形成生物膜,其中46株菌（31.08%）表现为强阳性,47（31.76%）和46（31.08%）株菌分别表现为中等阳性和弱阳性。结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜法检测淋球菌生物膜形成能力的结果呈正相关（Spearman 相关性分析,r=0.7948,P＜0.001）。结论:淋球菌最佳成膜时间为24h左右,临床菌株在体外普遍可以形成生物膜,结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜法检测结果一致性较好。第二部分:生物膜形成对淋球菌耐药性的影响目的:获得头孢菌素低敏或耐药淋球菌菌株对厄他培南的敏感性数据;评估淋球菌生物膜形成对头孢曲松、大观霉素、厄他培南、庆大霉素与唑利氟达星耐药性的影响。方法:2013至2019年间共收集259株对头孢曲松和/或头孢克肟低敏或耐药的淋球菌临床菌株,利用梯度扩散法检测它们对厄他培南的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）;随机选取生物膜形成能力强阳性、中等阳性、弱阳性各10株淋球菌临床菌株,利用微量肉汤稀释法测定淋球菌对头孢曲松、大观霉素、厄他培南、庆大霉素及唑利氟达星的MIC值和最低生物膜清除浓度（minimum biofilm eradication concentration,MBEC）值,Spearman 相关性分析用于比较每种抗生素MBEC与MIC、生物膜形成能力（OD600nm）之间的相关性。P＜0.05代表具有统计学差异。结果:259株淋球菌临床分离株的厄他培南MIC均在0.006 mg/L-0.38 mg/L之间;MIC50 和 MIC90 分别为 0.032mg/L 和 0.125mg/L。44（17.0%）株菌厄他培南MIC≥0.125mg/L;10（3.9%）株MIC≥0.25mg/L。头孢曲松、大观霉素、厄他培南、庆大霉素和唑利氟达星的MBEC均显著高于MIC,平均log2倍数变化分别为3.10、2.27、2.93、2.13和2.80。5种抗生素的MBEC和MIC之间均呈显著正相关关系;MBEC与生物膜形成能力（OD600nm）之间均无显著相关性。结论:头孢菌素低敏或耐药淋球菌菌株普遍对厄他培南有较高的体外敏感性。淋球菌生物膜可能在增强其抗生素耐药性方面发挥重要作用。第三部分生物膜状态和浮游状态下淋球菌的比较转录组学研究目的:比较淋球菌浮游状态和生物膜状态下的基因表达差异,在转录组学层面探讨淋球菌在生物膜状态下独特的基因表达模式。方法:选取生物膜形成能力强阳性和弱阳性的淋球菌临床菌株各1株,及FA1090（生物膜形成能力为中等阳性）,分别提取快速生长期及生物膜状态菌株的总RNA,送至苏州金唯智公司进行转录组学测序及数据分析,并通过RT-qPCR方法验证显著差异表达基因。结果:共获得178个差异表达基因,生物膜状态下表达上调的基因有27个,下调的有151个。进一步信息学分析发现,富集最明显的基因本体论术语是细胞外膜蛋白、孔蛋白活性（porin activity）和亚硝酸还原酶活性（nitrite reductase（NO-forming）activity）,京都基因和基因组百科全书富集信号通路主要包括ABC转运体、双组分调节系统、硫代谢途径、氮代谢途径等通路。在表达差异最显著的20个基因中,上调的基因主要涉及细菌毒素/抗毒素系统,下调的基因主要涉及接触依赖性生长抑制系统,另外,在生物膜状态下淋球菌macAB外排泵的macA基因的表达也显著上调。这20个显著差异表达基因的RT-qPCR结果与转录组测序结果基本一致。结论:相较于浮游菌,生物膜状态下的淋球菌有着独特的基因表达,深入研究这些表达差异显著的基因,有助于进一步探索淋球菌生物膜形成的相关机制。第四部分macA基因敲除对淋球菌生物膜形成的影响目的:研究macA基因敲除是否对淋球菌生物膜形成产生显著影响;初步探索macA基因敲除影响生物膜形成的可能机制。方法:选取FA1090作为实验菌株,使用同源重组技术构建macA基因敲除株及回补株,使用激光共聚焦显微镜法和结晶紫染色法测定野生株、敲除株和回补株的生物膜形成能力,绘制生长曲线,检测三个菌株生物膜中胞外多聚物（多糖、蛋白质和胞外DNA）的含量。结果:激光共聚焦显微镜下观察野生株、敲除株和回补株的生物膜形态,发现与野生株相比,macA敲除株生物膜荧光密度显著降低,而回补株荧光密度较敲除株升高,三个菌株的生物膜厚度分别是23.70μm,5.10μm和22.14μm,结晶紫染色法检测三个菌株的OD600nm值分别是0.31,0.13和0.31。野生株、敲除株和回补株的生长速率无明显差异。敲除株生物膜中多糖和蛋白质的含量分别为6.13μg/mL和6.03μg/mL,较野生株显著减少（14.66μg/mL和10.06μg/mL）,而回补株生物膜中多糖和蛋白质的含量（14.16μg/mL和9.83μg/mL）与野生株无显著差异。野生株、敲除株和回补株生物膜中胞外DNA的含量分别为15.37μg/mL、14.94μg/mL和15.23μg/mL,无显著差异。结论:macA基因表达在淋球菌生物膜形成过程中发挥重要作用,其可能通过调控多糖和蛋白质的外排而影响淋球菌生物膜的形成。