背景与目的 肿瘤的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖、分化和凋亡失调的结果。作为“基因组卫士”(guardian of genome)的 p53 基因,是迄今发现与人类肿瘤相关性最为密切的一个抑癌基因,人类 50%以上的肿瘤可检测出 p53 基因的突变。突变型 p53(mp53)不仅能以“显性负效应”阻碍野生型 p53(wp53)的抑癌功能,而且还能“重获新功能”,具有异常的转录激活、降低基因组 DNA 稳定性、抑制细胞分化、刺激肿瘤细胞无限增殖等癌基因的活性。转染 wp53 基因治疗肿瘤,在体外研究中已显示明显的抑癌效应,但临床研究效果却不理想。近年,国内外已有用反义寡聚核苷酸(ASO)、核酶(ribozyme, RZ)阻止或修复 mp53 基因表达的报道。 脱氧核酶(DNAzyme, DZ)是一种崭新的、能够抑制细胞内 RNA 表达的核酸分子。它是通过对体外合成的随机序列进行筛选获得的、具有 RNA 切割功能的 DNA 分子。其中, -23”型脱氧核酶(“10-23”DZ) “10功能最强,此酶由一个 15 个核苷酸(nt)的催化中心和与靶 RNA 碱基互补的两个侧翼序列构成,能在靶 RNA 未配对的嘌呤和配对的嘧啶残基之间发生序列特异性切割效应。目前,“10-23”DZ 的应用研究在病毒感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等方面已取得了不同程度的进展,但尚没有脱氧核酶抑制突变型 p53 基因表达的研究。 本研究针对突变型 p53(R273H) mRNA 设计三种脱氧核酶,观察其在无细胞体系切割 mp53 mRNA 的有效性和特异性,体外筛选出能有效切割 mp53 mRNA,对 wp53 mRNA 无切割或切割效率不高的 DZ。4观察其在HT29结肠癌细胞内抑制mp53 mRNA和蛋白质表达的效应及对 HT29 细胞的生长抑制作用,探索脱氧核酶在肿瘤 p53 基因治疗的可能性。方 法 1. 设计合成 DZ:根据 p53 突变数据库的信息以及文献报道的人类肿瘤 p53 基因突变的特征,结合“10-23”DZ 切割 RNA 特点,用RNAstructure 及 RnaViz 软件分析 p53 mRNA 的二级结构,综合分析并设计合成针对 mp53 的“10-23”DZ。2. 无细胞系统观察 DZ 切割效应:RT-PCR 分别扩增 HT29 细胞的mp53 和 A549 细胞的 wp53 的 cDNA 片段(345bp),将其定向克隆到pBluescript II KS(+)噬菌体 T7 启动子的下游,获得重组质粒 mp53pBs和 wp53pBs,经体外转录分别获得 392bp 的突变型和野生型 p53 基因的单链 RNA 片段,作为 DZ 切割反应的底物。在适当镁离子浓度、温度、PH 值的条件下观察所设计的“10-23”DZ 对底物的切割效应。3. 细胞内观察 DZ 效应:经脂质体或胆固醇将筛选出的 DZ 或 ASO转染入 HT29 结肠癌细胞株,RT-PCR 检测 mp53 mRNA 水平,观察各种DZ及ASO对HT29细胞mp53 mRNA的影响,免疫细胞化学及ImagePro Plus 4.5图像分析系统检测mp53蛋白,观察各种DZ及ASO对mp53蛋白表达的影响。 MTT 法初步评估 DZ 抑制 HT29 细胞生长效应。结 果 1. DZ 的设计合成:综合各种因素设计合成针对 mp53 (R273H,CGT>CAT),在突变点之后第二、三个碱基之间发生切割、不同臂长的三种“10-23”DZ:p53DZ7、p53DZ9、p53DZ11 及与 p53DZ11 相同靶位的反义对照 p53ASO 和 DZ 突变体对照 mutp53DZ。为了增加 DZ 细胞内稳定性及细胞吸收率,结合体外筛选结果合成硫代和/或胆固醇修饰