深绿木霉挥发性物质的组分及功能研究

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木霉(Trichoderma spp.)是一类具有生防和促生功能的有益微生物,是重要的微生物杀菌剂菌株。为深入挖掘生防木霉资源,我们在灵芝连作土壤中开展了木霉菌的分离和筛选,发现部分菌株具有浓郁甜椰子香味。本文选取其中的3个木霉菌株,通过形态和分子鉴定手段明确了这3个菌株的分类定位,测定分析了其挥发性物质(volatile organic compounds,VOCs)的主要成分,测定了主要挥发物对植物病原菌的抑菌效果,探讨了挥发物对植物生长的影响。主要研究结果如下:(1)采用形态学鉴定和分子鉴定等方法,发现木霉分离株GL01、GL02、GL03菌落形态主要呈放射状,菌丝白色呈棉絮状,分生孢子呈椭圆形、表面光滑,分生孢子梗主轴上分枝分布较均匀,单生、对生或3~4个轮生。用ITS1/ITS4和RPB2-210F/RPB2-1450R基因联合建树结果发现,这3株木霉菌和深绿木霉(T.atroviride)的亲缘关系最近。结合形态及分子鉴定结果,将GL01、GL02、GL03鉴定为深绿木霉(T.atroviride)。(2)采用平板对扣法,测定了深绿木霉VOCs对大丽轮枝菌、葡萄座腔菌、樟疫霉、尖孢镰刀菌等4种植物病原菌的拮抗效果。结果发现,3株深绿木霉的VOCs对供试真菌均具有明显的拮抗效果,对大丽轮枝菌的抑菌效果最好,GL01、GL02、GL03的抑菌率分别达到75.16%、68.15%、80.25%。处理后的菌丝均出现变细、分隔增多,内含物变少或脂滴变大等现象。(3)采用Y型管生物测定等方法,测定了3株深绿木霉VOCs对植物生长的影响,结果发现,3株深绿木霉的VOCs均能促进拟南芥生长,主根长分别提高了42.04%、39.55%、41.59%,须根数分别增加了42.11%、31.58%、36.84%;这3株深绿木霉的VOCs同样能促进番茄的生长,并且能够显著引导番茄幼苗主根的生长方向,番茄幼苗的主根向含有VOCs方向的管道生长的概率均超过70%。(4)采用SMPE-GC-MS技术对深绿木霉VOCs进行检测,结果发现,这3株木霉菌的VOCs中,包含多种化合物,分别属于烷烃、烯烃、酯类物质和酮类物质等,其中含量最高的化合物为6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-pentyl-2H-pyran-2-one,6PP),该化合物产生与深绿木霉相同的甜椰子香味。结果还发现,6PP在这3株深绿木霉中的含量比例不同,GL01中占总VOCs的35.64%,GL02为46.66%,GL03为37.41%。(5)采用熏蒸法,测定了6PP纯品对大丽轮枝菌、葡萄座腔菌、樟疫霉、尖孢镰刀菌等4种病原菌菌丝的抑制能力,发现6PP浓度越高,病原菌菌丝生长越缓慢,并且菌丝出现一定程度的变细、分隔增多等现象。6PP对大丽轮枝菌的有效中浓(EC50)值为25.033μL/L;对樟疫霉的EC50为35.645μL/L;对尖孢镰刀菌的EC50为49.025μL/L;对葡萄座腔菌的EC50为32.214μL/L;测定了6PP纯品对松材线虫生长的影响,发现6PP能够抑制松材线虫的生命活动,6PP的浓度越高对其抖动频率抑制越明显;测定了6PP对拟南芥生长的影响,发现6PP能调节拟南芥的生长发育,低浓度的6PP能够促进拟南芥的生长发育,而高浓度的6PP会抑制其生长。(6)温室盆栽实验结果表明,深绿木霉GL01、GL02、GL03能够促进番茄幼苗的生长、并且能够抑制尖孢镰刀菌,有效防治番茄枯萎病,GL01、GL02、GL03的相对防效分别达到了80.00%、77.94%、78.46%。综上所述,本研究探明了深绿木霉GL01、GL02、GL03及其VOCs对多种植物病原菌的菌丝生长具有显著的抑制活性,对植物具有显著的促生能力和防病能力,丰富了生防菌木霉的菌物资源,还为深绿木霉生防机制研究及应用提供了理论基础,具有潜在的应有价值。
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