论文部分内容阅读
近年来，HD-RNAi(Host-delivered RNAi)或HIGS(Host induced genesilencing)被越来越多地应用于植物病原菌包括真菌，卵菌等的抗病研究。但是HIGS在棉花抗土传维管束病原真菌----大丽轮枝菌中尚无研究报道;在自然侵染条件下，HIGS对于农作物是否具有保护作用也无相应的评估。为了探究HIGS在棉花抗大丽轮枝菌中的应用效果和机制，我们对一个潜在的HIGS靶标-大丽轮枝菌疏水蛋白基因Hydrophobin1（VdH1）-的致病性作用进行研究。VdH1敲除突变体（Vda⊿vdh1）不产生微菌核，能够侵染棉花并在棉花中扩繁增殖，但其引起的黄萎病的症状大幅减轻。我们进而将靶向VdH1基因的RNAi构建(VdH1i)转入棉花中，得到了能够稳定表达来源于VdH1i的siRNA的转基因棉花并进行抗病检测。相比于野生型，转基因棉花都表现出高效的抗性。从VdH1i转基因棉花分离得到的菌丝中我们检测到VdH1基因的降解以及VdH1 siRNA的积累，表明宿主植物能够传输siRNA到真菌细胞中并且诱导目标基因的沉默。新疆实地测试实验显示转基因棉花在黄萎病病圃中表现出了较好的抗性。我们的结果表明宿主棉花能够利用HIGS沉默大丽轮枝菌中的致病相关基因从而降低黄萎病的发病率。同时在拟南芥中表达靶向GFP的RNAi构建，利用双荧光(GFP/RFP)标记的大丽轮枝菌侵染GFPi拟南芥，发现GFPi产生的siRNA能够有效地降低GFP荧光。我们的结果在细胞生物学和分子生物学的角度证明了HIGS能够传递RNA沉默信号到大丽轮枝菌中诱导目标基因的沉默。 本研究表明，寄主植物中双链RNA介导的RNAi产生的siRNA能够引发真菌靶基因沉默并且使植物对病原真菌产生抗性。尽管这些发现揭示了病原真菌可以高效获取寄主RNAi，但是这一获取机制是否已经演化成为真菌和寄主互作中的一种天然生物功能仍是未知。我们发现大丽轮枝菌侵染棉花之后，棉花中的microRNA166(miR166)和miR159的表达量升高。我们对从侵染棉花中分离的菌丝进行小RNA高通量测序，发现一些棉花的miRNAs包括miR166和miR159，并通过Northern blot杂交验证。通过生物信息学寻找植物miRNAs的真菌靶标基因和分子生物学实验验证，结果表明miR166和miR159分别靶向真菌Ca2+依赖的半胱氨酸蛋白酶（Clp-1）和木霉素C-15羟化酶(HiC-15)基因并导致其沉默。两个基因的敲除突变大大降低在棉花的黄萎症状，表明这两个基因是大丽轮枝菌致病所必需的基因;另外，当大丽轮枝菌表达抗miRNA形式的Clp-1和HiC-15(Clp-1m和HiC-15m)时，其对棉花的致病性显著提高。因此，我们的结果揭示了一种新的寄主防御病原菌的策略，即寄主可以跨界输出特异的miRNA进入病原真菌中引起靶标致病性基因沉默从而获得抗性。