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盐碱化土地的有效利用已成为全球面临的重要问题。禾本科盐生植物星星草(Puccinelliatenuiflora)是一种优质牧草,具有较强的耐盐碱胁迫能力,能够在盐碱地上正常生长,已成为广为关注的耐盐碱植物基因资源。研究星星草耐盐碱的生理学特征与分子机制对于开发利用盐碱地、在分子水平理解植物耐盐碱的机制以及建立创制盐碱作物的生物技术体系均具有重要的意义。本论文分析了星星草基因组大小、对盐碱胁迫的耐受性以及在盐碱胁迫条件下基因表达谱的变化,探讨其耐盐碱的分子机理。
细胞学与流式细胞仪分析结果显示星星草为二倍体(2n=14),基因组大小约为1Gb。在实验室培养条件下,生长45天的星星草植物生理实验结果表明星星草具有耐受600mmolL-1NaCl和150mmolL-1Na2CO3(pH11.0)的能力,而当盐和盐碱浓度分别升高至900mmolL-1NaCl和200mmolL-1Na2CO3(pH11.0)时处理会导致植物死亡。这表明星星草有较小的基因组,具备较强的耐受盐和盐碱胁迫的能力,是研究单子叶植物耐盐碱胁迫的理想模式植物。
利用生物芯片技术,分析了星星草在不同浓度盐胁迫和盐碱胁迫条件下基因表达谱。利用Na2CO3(pH11.0)处理的星星草构建cDNA文库,测序11,039条EST,通过测序结果分析获得4,982条Unigene信息,基于这些Unigene的注释和同源比对,发现高比例的序列与水稻和大麦相应的序列有相似性,表明星星草与水稻和大麦的近缘关系。利用Unigene制备cDNA芯片,以不同浓度的NaCl和Na2CO3处理材料制备的cDNA作探针,通过与芯片杂交筛选到1,105个差异表达基因。功能注释结果显示这些差异表达基因主要涉及光合作用、氧化还原、信号转导和转录调控;几乎所有的细胞结构、光合作用和蛋白质合成功能相关基因在盐胁迫和盐碱胁迫下均表现为下调表达的特性。在盐碱胁迫下,Na2CO3浓度增加导致上调和下调基因数量显著增加,而在盐胁迫下,NaCl处理浓度的增加导致上调基因增加、下调基因数量减少。与盐胁迫相比,盐碱胁迫导致更多基因的表达水平发生变化,显著上调H+运输和柠檬酸合成相关基因的表达。这些结果表明星星草响应盐胁迫和盐碱胁迫机制具有不同以及保守的特征。
为了进一步研究星星草在正常、盐胁迫和盐碱胁迫3种生长条件下基因随时间变化的表达模式,采用二代测序技术SOLEXA方法。首先测序星星草的转录组,测序2Gb数据量,组装获得大于300nt的Unigene125,949条,平均长度为456nt,其中76.61%的基因在Nr数据库中得到注释。正下常生长0、1和6小时,NaCl处理1和6小时,Na2CO3处理1和6小时条件下取材,共7份样品进行数字表达谱测序,获得23,454个Unigene信息,其中7,313个变化倍数大于2的差异表达基因。对差异表达基因的生物信息学分析发现,随时间从1小时到6小时变化不同生长条件下的差异表达基因数量增加,尤其是上调表达基因;而盐碱胁迫条件下特异的差异表达基因在处理1小时明显少于盐胁迫,而在处理6小时显著增加,且远远超过盐胁迫应答基因数量。这些基因表达变化表明参与盐碱胁迫的基因应答过程较盐胁迫缓慢,反映出盐碱胁迫应答调控的复杂性。PCA分析显示,正常与胁迫生长条件主要区别在于植物细胞光周期节律作用、糖酵解/糖异生作用和多聚糖合成作用途径。星星草数字表达谱的测序数据揭示了不同生长条件下基因表达变化模式,以及植物对盐胁迫和盐碱胁迫应答机制的异同。